2-II细胞生物学研究方法.doc

1细胞生物学研究方法諰细胞形态结构的观察方法諰细胞组分的分析方法諰细胞培养、细胞工程与显微操作技术2细胞形态结构的观察方法蟰光学显微镜技术（Light Microscopy）蟰电子显微镜技术(Electro Microscopy)蟰扫描隧道显微镜(Scanning Tunneling Microscope )蟰扫描探针显微镜（Scanning Probe Microscope）3History of the MicroscopeA long time ago (around the 1stcentury) someone picked up a piece of crystal which was thicker in the middlelooked through it and discovered it made things look LARGER.4History of the MicroscopeThat piece of crystal was called a “magnifying glass”and then later was called a lensbecause it was shaped like a lentil seed. =5History of the MicroscopeThen, in the 13thcentury (1200s) an Italian inventor made the first eye glasses, allowing the wearer to have magnification. His name was SalvinoDArmate. Eye glasses were also called spectacles.6History of the MicroscopeThe earliest forms of magnification were magnifying glasses, usually between 6x to 10x, and were used for looking at tiny insects. These excited general wonder when used to view fleas or tiny creeping things and so were dubbed flea glasses. 7History of the MicroscopeIn the 1590s two Dutch eye glass makers named Zacharias Jensen and his father Hans, started experimenting with lenses8History of the MicroscopeThe Jansens put several lenses in a tube and made a very important discoverythe object at the end of the tube appeared MUCH larger than when it was under a plain magnifying lens!9History of the MicroscopeIn the late 1600s, Anton Van Leeuwenhoek became the first person to make and use a real microscope. 10History of the MicroscopeAnton Van Leeuwenhoek achieved even greater success than his peers by making superior lenses. He polished & ground up 550 lenses to make a lens tube with a magnification of 270x others were lucky to achieve 50x with their microscopes!11History of the MicroscopeAnton Van Leeuwenhoek was the first to see bacteria, yeast, and life found in a drop of pond water. He found extraordinary things using his microscope throughout his lifetime.12History of the MicroscopeAn English scientist named Robert Hooke further developed Anton Van Leewenhoekswork and in 1665 Hooke discovered cells. 13History of the MicroscopeRobert Hooke developed a primitive compound microscope14History of the MicroscopeRobert Hookes Micrographiawas known for stunning illustrations he did himself of the microscopic world.15History of the Microscope:Robert Hookes Cork Cells16History of the MicroscopeDespite these great discoveries, microscopes did not change much over the next 200 years. 17History of the MicroscopeIn the 1850s a German engineer named Carl Zeissbegan making adjustments to the microscopes he was manufacturing, making them even better.18History of the MicroscopeWith the advancement of technology and improved optics, the compound light microscope came into being.19Other types of microscopes:Electron MicroscopesUses a beam of electrons to illuminate and magnify a specimenVery expensive Huge20History of the Microscope21一、光学显微镜技术（light microscopy)普通复式光学显微镜（Compound Light Microscope）荧光显微镜（Fluorescence Microscopy）激光共焦扫描显微镜（Laser ConfocalMicroscopy）相差显微镜（phase-contrast microscope）微分干涉显微镜（differential interference contrast microscope，DIC）活细胞工作站（live cell station）221. 构成：（1）照明系统：光源(普通光线可见光)、折光镜、聚光镜、滤光片（2）光学放大系统：两组玻璃透镜目镜、物镜（3）机械装置：保证光学系统的准确配置和灵活调控2. 原理：是将两个凸透镜系统适当地组合在仪器上对标本进行放大，经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。（一）普通复式光学显微镜技术23普通复式光学显微镜镜筒镜筒载物台载物台聚光镜聚光镜光阑光阑粗动螺旋粗动螺旋微动螺旋微动螺旋照明装置照明装置基座基座光路图243.分辨率分辨率：是指区分开两个质点间的最小距离。指分辨物体最小间隔的能力。是显微镜最重要的性能参数。其中:为入射光波长；数值口径：Nsin/2；N=介质折射率；=镜口角（样品对物镜镜口的张角），通常最大值可达140。其中:为入射光波长；数值口径：Nsin/2；N=介质折射率；=镜口角（样品对物镜镜口的张角），通常最大值可达140。25几种介质的折射率介质 空气 水 香柏油 溴萘 折射率 1 1.33 1.515 1.66 显微镜的分辨率是由入射光波长和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率。可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可提高分辨率。要增加数值口径，可以提高介质折射率，香柏油的折射率和载片玻璃的折射率（1.52）相近，光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。显微镜的分辨率是由入射光波长和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率。可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可提高分辨率。要增加数值口径，可以提高介质折射率，香柏油的折射率和载片玻璃的折射率（1.52）相近，光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。2627sin /2的最大值小于1；油镜介质为香柏油，镜口率可接近1.5；普通光线的波长为400700nm，光镜分辨率约0.2m，人眼的分辨率为0.2mm，因此显微镜的最大有效倍数为1000X。28（二）荧光显微镜Fluorescence Microscope在光镜水平对特异蛋白质等大分子研究的最有力工具之一。1.特点：光源为短波光；有两个特殊的滤光片；需要特异荧光染料。2.原理：以紫外线为光源，经滤色系统发出一定波长的光作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行物体的形状及其所在位置的观察。293.结构荧光显微镜与普通光学显微镜相比较，增加了一些附件：荧光光源、激发光滤片和阻断滤片。荧光光源一般采用超高压汞灯(50-200W)，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫色、蓝色和绿色激发片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都过滤掉。阻断滤光片的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免干扰荧光和损伤眼睛。二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。30荧光显微镜光路图阻断滤片阻断滤片阻断滤片分光镜激发光滤片314.用途：用于观察能激发出荧光的物质。主要用于细胞结构和功能、细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等的研究。细胞内的某些成分可与荧光素结合而显荧光。如溴化乙锭与吖啶橙可与DNA结合，进行细胞内DNA含量测定；以异硫氰酸或罗丹明等荧光素标记抗体（一抗或二抗），用该标记抗体直接或间接地与细胞内的相应抗原结合，以检测该抗原的存在与分布。如绿色荧光蛋白(GFP)的应用32ActinIntermediate filamentsMicrotubules细胞核33341.特点：用激光作光源；能显示细胞样品的立体结构；对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。分辨率是普通光学显微镜的3倍；2.原理:用激光作光源，采用共轭聚焦的原理和装置，通过针孔的选择，逐点、逐行、逐面快速扫描，通过系统软件对数字图像分析处理获得三维图像。（三）激光共聚焦扫描显微镜（LCSM）LSCM：Laser confocalscanning microscope353、结构：激光共聚焦显微镜主要由四部分组成：（1）自动显微镜：物镜组的转换，滤色片组的选取，载物台的移动调节，焦平面的记忆锁定都应由计算机自动控制。（2）扫描装置：共聚焦光路通道和针孔、扫描镜、检测器扫描系统的工作程序由计算机自动控制。（3）激光光源。（4）检测系统：数字信号处理器、计算机以及图象输出设备（显示器、彩色打印机）等364.用途:排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨(1.41.7，与荧光显微镜相比)，可重构样品三维结构。主要用于研究亚细胞结构和组分定位和动态变化。细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化、细胞凋亡机制；各种细胞器、结构性蛋白、DNA、RNA、酶和受体分子等细胞特异性结构的含量、组分及分布进行定量分析；DNA、RNA含量、利用特定的抗体对紫外线引起的DNA损伤进行观察和定量；分析正常细胞和癌细胞细胞骨架与核改变之间的关系；细胞黏附行为等。37激光共聚焦显微镜（LCSM）38激光共聚焦扫描显微镜光路图激光共聚焦扫描显微镜光路图39非洲爪蟾属黑色素细胞微管骨架（绿）和细胞核（蓝）40普通荧光显微镜vs. 激光共聚焦显微镜小鼠脑海马区大鼠平滑肌向日葵花粉411、特点：将光程差或相位差转换成振幅差。不需要染色环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相差板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/42、原理：光线透过不同密度的物质时滞留时间长短不同，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。肉眼能够辨认出来。（四）相差显微镜phase-contrast microscope423、结构：相差显微镜与普通显微镜主要不同之处在于用环状光栏代替可变光栏，用带相板(phase plate)的物镜(通常用“ph”标志)代替普通物镜。这些特殊装置能使活细胞或末经染色的标本中各部分的折射率或厚度的微小差异，产生相位差，然后利用光的衍射和干涉的原理，把相差变成振幅(明暗)之差，使人的肉眼能够辨认出来。4、用途：可用于观察活细胞，观察未经染色的玻片标本，甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动态。43观察未经染色的玻片标本。44Bright field vs. Phase contrast45（五）微分干涉显微镜Differential interference contrast microscope （DIC）1952年Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器。DIC显微镜下的硅藻DIC显微镜下的硅藻46检偏振器检偏振器起偏振器起偏振器棱镜棱镜2束平面偏振光2束平面偏振光偏振器偏振器一束培养大鼠海马神经的生长一束培养大鼠海一束培养大鼠海马神经的生长马神经的生长上皮细胞上皮细胞上皮细胞47计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活细胞中的颗粒及细胞器的运动采用组合方式，集普通光镜、相差、荧光、DIC、摄影装置于一体；自动化与电子化。（六）活细胞工作站（六）活细胞工作站48二、电子显微镜技术裰电子显微镜的基本知识裰电子显微镜的基本构造裰电镜与光镜的比较裰电镜与光镜光路图比较裰主要电镜制样技术裰超薄切片技术裰负染色技术裰冰冻蚀刻技术裰扫描电镜技术（Scanning electron microscope，SEM）裰扫描隧道显微镜SPM (Scanning probe microscope)491. 电子显微镜基本构造以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束波长与加速电压(通常50120KV)的平方根成反比；由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统等4部分构成；分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍；用于观察超微结构（小于0.2m）。（一）电子显微镜的基本知识50透射电子显微镜TRANSMISSION ELECTRONMICROSCOPE，TEM51电子显微镜的基本构造电子枪电子枪阳极阳极聚光镜聚光镜样品室样品室物镜物镜中间镜中间镜投影镜投影镜观察窗观察窗荧光屏荧光屏52锇和其他重金属染色的根尖电镜照片. The cell wall, nucleus, vacuoles, mitochondria, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, and ribosomesare easily seen. 锇染色锇染色锇染色质体质体质体532.电镜与光镜的比较利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa玻璃透镜玻璃透镜电磁透镜可见光（400-700）紫外光（约200nm)电子束（0.01-0.9）200nm100nm0.1nmLMTEM成像原理真空透镜光源分辨本领显微镜54电子束 名 称 可见光 紫外光 X射线 射线 0.1Kv 10Kv 波长（nm） 390760 13390 0.0513 0.0051 0.123 0.0122 表2 不同光线的波长5556(二)电子显微镜制样技术1.超薄切片技术:用于电镜观察的样本制备超薄切片厚度仅50nm左右，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过取材、固定、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色等步骤。通常以锇酸（四氧化锇(OsO4)）和戊二醛( C5H8O2)固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。572.负染技术:背景染色，衬托出样品的精细结构(用重金属盐(如磷钨酸) 染色；吸去染料干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。古细菌的负染58用重金属盐(如磷钨酸钠、醋酸铀等)对铺展在载网上的样品进行染色，使整个载网都铺上一层重金属盐，而有凸出颗粒的地方则没有染料沉积。由于电子密度高的重金属盐包埋了样品中低电子密度的背景，增强了背景散射电子的能力以提高反差，这样，在图像中背景是黑暗的，而未被包埋的样品颗粒则透明光亮，这种染色称为负染技术。负染色是只染背景而不染样品，与光学显微镜样品的染色正好相反。593.冰冻蚀刻技术freeze-etching冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露断面结构。向断面喷涂一层蒸汽铂和碳。然后将组织溶掉，把铂和碳的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。60生物样品在液氮中(-196)进行快速冷冻，迅速转移到冷冻装置中，并迅速抽成真空。在真空条件下，用冰刀横切冰冻样品，使样品内层被分开露出两个表面。冰在真空中升华，使得样品表面上浮雕出超微结构。对浮雕表面进行铂-碳复型，并在腐蚀性溶液中除去生物材料，复型经重蒸水多次清洗后，置于载网上作电镜观察。61培养细胞内面的深度蚀刻电镜照片，显示网格蛋白网格蛋白衣被62（1）特点观察标本表面结构。20世纪60年代问世；分辨率为610nm，因人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题5.扫描电镜技术63Scanning electron microscope（SEM）64（2）工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。65蛙内耳毛发细胞硬纤维投影：扫描电镜蛙内耳毛发细胞硬纤维投影：扫描电镜(A).微分微分干涉差显微镜干涉差显微镜(B) 电镜（超薄）(C).不同显微镜图象比较不同显微镜图象比较66（三）扫描隧道显微镜scanning tunneling microscope，STM(80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器)1、原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。即根据隧道效应设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。67结构装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。特点：(1)分辨本领高;(2)可直接探测样品表面结构，测量厚度信息，绘出立体三维图象；(3)可在真空、大气、液体等多种条件下工作；实现非破坏性测量。(4)可连续成像，进行动态观察。用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构。固态、液态和气态）物质均可进行观察。68逼近装置扫描针尖逼近装置扫描针尖带电极的压电陶瓷带电极的压电陶瓷隧道电流放大器隧道电流放大器数据处理显示数据处理显示反馈控制系统反馈控制系统1981年，瑞士人G.Binnig和H.Rohrer在IBM苏黎世实验中心（Zurich Research Center）发明了扫描隧道显微镜而与电镜发明者Ruska同获1986年度的诺贝尔物理学奖。69MicroscopyINSERT FIGURE 4.370二、细胞组分的分析方法离心分离技术特异蛋白抗原的定位与定性细胞内特异核酸的定位与定性定量细胞化学分析技术71一、离心分离技术是分离细胞器及各种大分子的基本手段。转速1025kr/min的离心机称为高速离心机。转速25kr/min，离心力89Kg者称为超速离心机。超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500kg。差速离心：分离密度不同的细胞组分密度梯度离心：分离精细组分或生物大分子72（1）差速离心Differential centrifugation特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心。用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。(分离密度不同的细胞组分)沉降顺序：核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。73Low speedHigh speed差速离心74不同的细胞器、大分子和病毒的密度及相应的沉降系数75（2）密度梯度离心(分离精细组分或生物大分子用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。类型：速度沉降、等密度沉降。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。761. 速度沉降velocity sedimentation用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。特点：介质密度较低原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。772.等密度沉降Equilibrium sedimentation用途：分离密度不等的颗粒。特点：介质密度高，陡度大力场比速率沉降法大10100倍，需要高速或超速离心。原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。78Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation稳定蔗糖梯度稳定蔗糖梯度离心离心分级分离分级分离陡蔗糖梯度陡蔗糖梯度速度沉降速度沉降等密度沉降等密度沉降79免疫荧光技术：将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限。（二）特异蛋白抗原的定位与定性（二）特异蛋白抗原的定位与定性80（三）细胞内特异核酸的定位与定性光镜水平的原位杂交技术（同位素标记或荧光素标记的探针）电镜水平的原位杂交技术（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）81分子杂交技术具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。原位杂交（in situhybridization）用于检测染色体上的特殊DNA序列。82人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片83（四）定量细胞化学分析技术利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。包括：紫外光显微分光光度测定法、可见光显微分光光度测定法流式细胞仪（Flow Cytometry）主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离DNA含量不同的中期染色体。84流式细胞术(Flow cytometry)流式细胞术(Flow cytometry)原理:包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞仪（flow cytometer）。用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。滴液形成振荡器滴液形成振荡器细胞悬浮液细胞悬浮液鞘液鞘液液滴液滴带电少的液滴带电少的液滴带电多的液滴带电多的液滴收集不带电荷的液滴收集不带电荷的液滴滤片屏障滤片屏障高压偏转板高压偏转板85三、细胞的培养1.几个基本概念:原代培养（primary culture）：培养来自动物机体的细胞群。将细胞转移到新的容器中培养称为传代或传代培养（passage）。细胞系（cell line）：原代培养细胞成功传代即为细胞系。亚二倍体，接触抑制丧失。克隆（clone）：亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。86872.动物细胞培养群体培养（mass culture）：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence）后形成均匀的单细胞层；克隆培养（clonalculture）：培养高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁生长，每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。88群体培养克隆培养891231：细胞培养皿2：细胞培养板3：细胞培养瓶90实验室中常用的几种细胞系中国地鼠卵巢细胞CHO小鼠骨髓瘤浆细胞SP20人肠癌细胞HCT116小鼠胚胎成纤维细胞MEF人肺癌细胞H1299人乳腺癌细胞MCF7大鼠胶质瘤细胞C6Henrietta Lacks 宫颈癌上皮细胞HeLa小鼠成纤维细胞3T3来源细胞类型细胞系名称91Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养92培养细胞的特性培养细胞的生长方式:贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长，见于各种实体瘤细胞。悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面，见于各种造血系统肿瘤细胞。93细胞传代方法根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。1悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2 半悬浮生长细胞传代此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。94贴壁生长细胞传代方法1 吸光培养瓶中的培养液2 加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10 min（显微镜下动态监测）。3 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。4 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。5 吸取1/101/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。6 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。7 将后者放入培养箱中培养。95培养细胞活力测定细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。1 细胞克隆形成率实验单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成卒用来表示细胞的增殖能力克隆形成率比克隆形成数接种细胞数96单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成卒用来表示细胞的增殖能力。克隆形成率比克隆形成数接种细胞数1、细胞克隆形成率实验Mel-CVMel-CVRPLX4032972、台盼蓝法活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力。983、四唑盐（MTT）比色法四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝，四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能，最后用酶标仪测定OD值。MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。994、细胞增殖测定：BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)vs.EdU(5-乙炔基-2脱氧尿嘧啶核苷)：胸腺嘧啶核苷类似物BrdU：需要通过BrdU抗体介导的免疫荧光染色EdU：可以和Apollo荧光染料特异性地结合100四、细胞工程1.细胞融合（cell fusion通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交。同核体：相同基因型的细胞融合而成。异核体：不同基因型的细胞融合而成。自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。诱导细胞融合的方法：生物方法（仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电击和激光）。101102Tumor suppressor genes:identified by cell fusionFirst discovered in 1960s by Henry Harris.Harris fused tumor cells with normal cells and discovered some of the hybrid cells were normal.Harris hypothesized that the normal cells produced gene products that suppressed uncontrolled cell proliferation.103Cell fusionMalignantNormalHybrid104Results of FusionsHybrid cells grow like normal cellsMalignant growth characteristics are recessive. Normal cell suppresses abnormal growthWhen certain chromosomes from normal cell are lost in hybrid,