9B遗传物质的结构和性质.ppt

B型DNA仅仅是众多DNA双螺旋构象中的一种 在外界条件的改变下 双螺旋的构象也会改变 模型中的碱基配对有何重要性 A T G C配对可形成很好的线性氢键 A T对和G C对的几何形状一样 使双链距离相近 使双螺旋保持均一 碱基对处在同一平面内 不论核苷酸的顺序如何 都不影响双螺旋的结构 为DNA半保留复制奠定了基础 螺旋桨效应 第三节DNA的结构和性质 一 DNA二级结构的稳定因素 1 碱基对之间的氢键 2 碱基的堆集力 它包括 疏水作用 范德华力 磷酸基的负电荷斥力 碱基配对及氢键形成 腺苷 AR 脱氧胞苷 dCR 1 N9 糖苷键 1 N1 糖苷键 C2 C4 二 双螺旋结构的构象变异 DNA的构象现已知有A B C D E T Z7种 引起DNA双链构象改变有以下因素 1 核苷酸顺序 2 碱基组成 3 盐的种类 4 相对湿度 Z DNA的发现 1972年Pohletal发现poly dG dC 在高盐下旋光性发生改变 1979年WangA H J 王惠君 A Rich对d CGCGCG 单晶作X衍射分析提出Z DNA模型 三左旋DNA 一 Z DNA的结构特点 1 糖磷骨架呈 之 字形 Zigzag 走向 2 左旋 3 G的糖苷键呈顺式 Syn 使G残基位于分子表面 4 分子外形呈波形 5 大沟消失 小沟窄而深 6 每个螺旋有12bp 目前已知DNA双螺旋结构可分为A B C D及Z型等数种 除Z型为左手双螺旋外 其余均为右手双螺旋 Z DNAB DNA 生化专业术语委员会建议用俯视图 N9 C1 0 90 时为顺式 syn 180 90 时为反式 anti 嘌呤核苷的扭转角为X C4 N9 C1 0 嘧啶核苷的扭转角为X C2 N1 C1 0 习惯用法是 X 60 0 120 为顺式 X 120 180 60 为反式 60 60 0 90 0 120 90 180 90 120 180 90 嘌呤 C4 嘧啶 C2 顺式 反式 核苷的顺反构象 Z DNA存在的条件 1 高盐 NaCl 2Mol L MgCl2 0 7Mol L 2 Pu Py相间排列 3 在活细胞中如果m5C 则无需嘌呤 嘧啶相间排列 在生理盐水的浓度下可产生Z型 4 在体内多胺化合物 如精胺和亚胺及亚精胺和阳离子一样 可和磷酸基因结合 使B DNA转变成Z DNA 5 某些蛋白质如Z DNA结合蛋白带有正电荷 可使DNA周围形成局部的高盐浓度和微环境 6 负超螺旋的存在 三 生物学意义 1 可能提供某些调节蛋白的识别 啮齿类动物病毒的复制起始部位有d GC 有交替顺序的存在 2 在SV40的增强子中有三段8bp的Z DNA存在 3 原生动物纤毛虫 它有大 小两个核 大核有转录活性 小核和繁殖有关 Z DNA抗体以萤光标记后 显示仅和大核DNA结合 而不和小核的DNA结合 说明大核DNA有Z DNA的存在 可能和转录有关 四 DNA的三级结构 所谓DNA的三级结构 是指在一二结构基础上的多聚核苷酸链上的卷曲 在一定意义上 是指双螺旋基础上的卷曲三级结构包括链的扭结和超螺旋或者是单链形成的环或是环状DNA中的连环体 超螺旋 Supercoied 松驰型DNA relaxform 超螺旋 Supercoied DNA 负超螺旋正超螺旋检测DNA三级结构的方法 密度梯度离心凝胶电泳电镜观察 一 DNA的超螺旋结构 原核生物DNA的三级结构 绝大多数原核生物的DNA都是共价封闭的环状双螺旋 如果再进一步盘绕则形成麻花状的超螺旋三级结构 超螺旋的定量描叙 White方程 L T WL Linkingnnmber 链环数或称拓扑环绕数 指cccDNA中一条链绕另一条链的总次数 其特点是 1 L是整数 2 在cccDNA中任何拓扑学状态中其值保持不变 3 右手螺旋对L取正值 W Writhingnumber 扭曲数 即超数旋数 其特点是 1 可以是非整数 2 是变量 3 右手螺旋时 W取负值 T Twistingnumber 缠绕数 即双螺旋的圈数 其特点是 1 可以是非整数 2 是变量 3 右手螺旋时T为正值 超螺旋的量度可以用超螺旋密度 来表示 L T T在天然DNA中 约为 0 05 二 三链和四链DNA 这些DNA分子的结构单元分别是三碱基体和四碱基体 这些碱基体通过Watson Crick氢键配对和Hoogsteen氢键配对相互作用而结合成共平面聚合体 Watson Crick HoogsteenWatson Crick reversedHoogsteenReversedWatson Crick HoogsteenReversedWatson Crick reversedHoogsteen 三链DNA 基本结构 Py Pu Py构象 如T A T C G C Pu Pu Py构象 如A A T G G C H DNA 鸟嘌呤四聚体 第四节DNA的变性与复性 变性 denaturation 或解链 melting 复性 renaturation 或退火 annealing 成核作用 nucleation 拉拉链作用 Zippering DNA的复性对片段有两个要求 1 互补顺序的碰撞和排列 2 碱基的正确配对和氢键的形成 下列因素可导致DNA变性 高温 酸 碱 尿素 甲酰胺DNA变性后物理性质发生的变化 1 流体力学的性质发生改变 粘度下降 而沉降速度增加 2 提高了对紫外线的吸收能力 此称为增色效应 hyperchromiceffect 双链DNA的A260 1 00 浓度为50 g ml时 对波长260nm紫外线的吸收能力 单链DNA的A260 1 37 游离碱基或核苷酸的A260 1 60 解链温度 meltingtemperature Tm 或熔点 Tm是A260的升高达到极大值一半时的温度 即是变性温度范围的中点 影响变性的因素 外部条件如温度和正离子的浓度 浓度低于0 4mol L 单价阳离子增高10倍 Tm增加16 6 内部条件GC含量及分子类型当GC的含量上升1 则Tm上升0 4 马默多蒂 Marmur Doty 关系式 Tm 69 3 0 41 G C 或GC Tm 69 3 2 44 复性动力学公式 C11C021 KC0t1 2根据复性动力学公式我们可以知到些什么 复性进行一半时 1 单链浓度随着时间的增大而减小 2 反应速率取决于初始的单链浓度Co 3 以反应浓度和COt1 2为座标可绘复性曲线 4 通过COt1 2值可测原核生物基因组的大小 已知大肠杆菌的基因组为4 2x106bp COt1 2 9M SecCOt1 2 任何基因组DNA 9M sec 任何基因组大小 4 2X106bp 5 原核生物基因组大小不同 复性曲线也不同 6 可用以区分真核生物和原核生物基因组 单一顺序和重复顺序复性动力学曲线的区别 真核生物的DNA有重复顺序 而原核生物多为单一顺序 1 单一顺序的复性曲线常只有一个拐点 而重复顺序常有多个拐点 2 COt比值变化范围 原核生物的COt比值为100 真核生物的COt比值大于100 影响复性反应的因素 1 DNA片段的大小 2 DNA的浓度 3 DNA复杂性 4 温度 最佳复性温度一般比Tm低25 C 5 盐的浓度 复性时要求盐的浓度达到足够高 为什么 在复性反应中如何知道单链已经结合成双链了呢 可以通过哪些法来检测 1 减色效应 hpochromiceffcef 测定光密度 即OD值 opticaldensity DNA从单链变成双链 OD260减少30 2 羟基磷灰石柱层析羟基磷灰石对双链DNA吸附较牢 不易吸附单链 第五节分子杂交 分子杂交 molecularhybridization 共同特点是 1 都是应用复性动力学原理 2 都必须有探针 probe 的存在 探针就是用同位素或非同位素如荧光染料 生物素等标记的短片段特异DNA或RNA顺序 常用的分子杂交方法