细胞培养综述.doc

学习资料收集于网络，仅供参考动物细胞培养综述摘要：动物细胞培养是指在体外培养动物细胞的技术，即在无菌条件下，从机体中取出组织或细胞，或利用已经建立的动物细胞系，模拟机体内的正常生理状态下生存的基本条件，让细胞在培养容器中生存、生长和繁殖的方法。动物细胞培养开始于本世纪初，到1962年规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。由于动物细胞体外培养的生物学特性、相关产品结构的复杂性和质量以及一致性的要求，动物细胞大规模培养技术仍然难于满足具有重要医用价值生物制品的规模生产的需求，迫切需要进一步研究和发展细胞培养工艺。目前，世界众多研究领域集中在优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率并保证其质量和一致性上。本文介绍了关于动物细胞培养技术的起源史，动物细胞培养的技术基本概念，当前培养技术的特点、环境和生长条件、方式，以及现代化的动物细胞培养技术的应用现状和存在的问题与展望。从而让更多的人了解技术的使用，使我们这项技术得到更广更好的发展。Abstract：Animalcellculturereferstoacultureofanimalcellsinvitrotechniques，namelyunderasepticconditions,wasremovedfromthebodytissueorcells,orusingtheanimalcelllineshavebeenestablished,thebasicconditionsforsurvivalunderthenormalphysiologicalconditionofthebodyofthesimulator,cellsurvival,growthandreproductionintheculturevessel.Animalcellculturestartsatthebeginningofthiscentury,the1962scalebegantoexpand,thedevelopmenthasbecomewidelyusedinbio-medicalresearchandapplicationtechnology,theuseofanimalcellcultureproductionofanimportantmedicalvalueofenzymes,growthfactors,vaccinesandmonoclonalantibody,hasbecomeanimportantpartofthemedicalandbiologicalhigh-techindustry.Biologicalcharacteristicsofanimalcellsculturedinvitro,thecomplexityandthequalityandconsistencyoftherequirementsoftheproductstructure,large-scalecultivationofanimalcellsisstilldifficulttomeetthedemandscaleproductionofanimportantmedicalvalueofbiologicalproducts,thereisanurgentneedforfurtherresearchandThedevelopmentofcellculturetechnology.Currently,manyoftheworldsresearchfocusesontheoptimizationofthecellcultureenvironment,changesincellularcharacteristics,toimprovetheyieldoftheproductandtoensureitsqualityandconsistency.Thispaperintroducesthehistoryoftheoriginofanimalcellculturetechnology,animalcellculturetechnologyconcept,thecurrent culturecharacteristics,environmentandgrowthconditions,means,andthemodernizationofanimalcellculturetechnologyandtheexistingproblemsofapplicationandProspectof.Inordertoletmorepeopleunderstandtheuseoftechnology,sothatwethetechnologygetmoreandbetterdevelopment.关键词：动物细胞、培养特点、条件、方式、生物反应器、面临问题、研究进展一基本概念细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的一种培养技术。从体内取出细胞首次培养即为原代培养，这是细胞培养的最初和必经阶段。当原代培养细胞生长到一定时期，受到群体环境限制，就需要转移到另一容器才能继续生长，称为传代或继代培养。根据原代培养物性状的一致性与否，传代成功后称为细胞系或细胞株。这些细胞一般可顺利传4050代次，并保持染色体二倍体数量和接触抑制，传至50代左右时则出现生长停滞，大部分衰老死亡，此类称为有限细胞系/株；在细胞传代过程中，有些发生遗传突变获得了持久性增值能力的细胞称为无限细胞系/株。二动物细胞培养的特点动物细胞属于真核细胞，结构和成分更复杂，功能也更全面。动物细胞之间的连接形式要比植物细胞复杂的多，主要有紧密连接、间隙连接、隔壁连接、中间连接和桥粒连接五种形式。紧密连接、间隙连接和桥粒连接相对普遍，隔壁连接仅见于无脊椎动物细胞，中间连接见于脊椎动物细胞。动物细胞具有以下特点：1、动物细胞比微生物细胞大，无细胞壁。2、动物细胞倍增时间长，生长缓慢。3、培养过程需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感。4、动物细胞间主要以聚集体形式存在。5、原代细胞一般繁殖50代左右即退化死亡。6、动物细胞对于营养要求更加苛刻，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，一般还需要血清。7、对于培养环境极其敏感，包括pH、溶解氧、温度、剪切力等。8、细菌、真菌、病毒、支原体均可导致动物细胞培养物的污染。9、绝大多数哺乳动物细胞只有贴附在固体或半固体的表面才能生长。体外培养的细胞从适应环境、旺盛生长到由于自身和环境限制缓慢或停滞生长需要经历一个周期变化，可分为：潜伏期、指数生长期和稳定期。潜伏期：细胞从接种到适应新环境生长繁殖的一段时间，此间细胞胞质回缩，代谢缓慢。指数生长期：它是细胞活力最好的时期，细胞增殖旺盛，在接种细胞数量适宜的情况下，指数生长期持续35天后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，营养环境恶化，呈现接触抑制，恶性细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密度抑制。稳定期:细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液的交换面积减少，代谢产物积累，pH值下降，细胞停止增殖，进入停滞期，营养环境继续恶化后，细胞受损直至死亡。三细胞培养环境和生长条件1、无毒无菌环境：无毒无菌的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞，由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物和有毒物污染，或者自身代谢物质积累，就可能会导致细胞中毒死亡，因此，在体外培养细胞时，应即时消除细胞代谢产物，以保证细胞生长环境无菌无毒。2、恒温：要维持培养的细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度，与多数哺乳动物体内温度相似，培养细胞的最适温度为37。实践证明，细胞对低温的耐受性要比对高温的耐受性强些，低温下会使细胞生长代谢速率降低，一经恢复正常温度时，则细胞会再行生长。高温对细胞威胁很大，若在40左右，则在几小时内细胞便会死亡。3、pH：细胞培养的pH最适为7.27.4之间，多数类型的细胞对偏酸性的耐受性较强，而在偏碱性的情况下则会很快死亡。4、气体：细胞的生长代谢离不开O2。作为代谢产物的CO2还有调节pH的作用。CO2培养箱可根据需要持续地提供一定比例的CO2气体，这样便可以将培养环境中的氢离子浓度保持恒定以提供一个比较稳定的pH范围。5、培养基：动物细胞对营养的要求较高，培养液里的成分要满足细胞进行糖代谢、脂代谢、蛋白质代谢及核酸代谢所需要的各种营养，例如，包括十几种必须氨基酸及其他多种非必须氨基酸、维生素、碳水化合物及无机盐类等，其中很多成分采用血清、胚胎浸出液等提供。在很多情况下需加入10的胎牛或小牛血清。血清使用前必须经过鉴定，只有无菌、无内毒素、无溶血或低溶血、蛋白质以及营养素达一定标准以上的血清才能使用。动物细胞的培养基一般可分为天然、合成、无血清培养基几种。四细胞培养方式1、贴壁培养：其主要适用于贴壁依赖性细胞，一般源于实体组织的细胞需要相互依赖，需贴附于不起化学作用的物质（玻璃或塑料等无活性物质）的表面生长、生存和维持，并最终在附着面生长至单层，铺满平面时便会发生接触抑制。2、悬浮培养：悬浮适应细胞、源于循环系统的细胞及肿瘤细胞等非贴壁依赖性细胞无需支撑面，细胞或细胞聚集体悬浮液于液体培养基中增殖，悬浮培养是大规模细胞培养的理想方式。3、灌注小室培养:将细胞接种于一个由上而下的盖玻片于一个金属圈密封围城的小室内，保持在一定条件下培养。在小室内的侧面分别有液体流入和流出的开口，供新鲜培养液流入小室和旧培养液排出。这种方法的显著特点是营养液可以循环供应，细胞生长可以尽量少受代谢产物积累的影响。4、固定化培养：它是一种包埋培养方式，适用于贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞。它具有剪切力低、传递效率好和抗污染能力强、细胞生长密度高、产物易于收集和分离纯化等特点。（1）微载体：微载体细胞培养法是一种用于培养锚地依赖性细胞的大规模培养技术，这种培养技术是在生物反应器内加入培养液和一种对细胞无毒害作用的材料支撑的颗粒（微载体），使细胞在微载体表面附着和生长，并通过不断搅拌使微载体保持悬浮状态，培养液中大量的微载体为细胞提供了极大地附着表面，1g微载体其比表面积可达6000cm2，从而可实现细胞的高密度培养。微载体的直径在60250um，由天然葡聚糖、凝胶或各种合成的聚合物组成，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。由这些材料及其改良型制成的微载体主要参考了细胞的粘附特性，在其表面带有大量电荷及其他生长基质物质，因而有利于细胞的粘附、铺展和增殖。采用微载体培养具有以下特点：比表面积大，单位体积培养液的细胞产率高；采用均匀悬浮养，无营养物或产物梯度；可用简单显微镜观察微载体表面的生长情况；细胞收获过程相对简单，劳动强度小；培养基利用率高，占地面积小；放大容易，国外已有公司以1000L规模培养人的二倍体细胞来生产-干扰素。但其缺点是搅拌桨及微珠间的碰撞易损伤细胞；接种密度高；微载体吸附力弱，不适合培养悬浮型细胞。（2）包埋：将动物细胞包埋在各种多聚物多孔载体中而制成固定化动物细胞的方法称为包埋。此法步骤简便，条件温和，负荷量大，细胞泄露小，因细胞嵌入在高聚物网格中而受到保护，细胞能抗机械剪切。但该法也有一定的缺点，如扩散限制，并非所有细胞都处于最佳营养物浓度。包埋法一般适用于非锚地依赖性细胞的固定化，多孔凝胶是最常用的载体，用于动物细胞固定化的凝胶主要有海藻酸钙、琼脂糖、血纤维蛋白等。（3）中空纤维：中空纤维细胞培养技术模拟细胞在体内生长的三维状态，；利用人工的“毛细血管”中空纤维来提供给细胞生长的营养。培养系统的核心部分由36层空心纤维组成，培养时将待培养细胞接种于空心纤维的外腔。中空纤维技术的优点是无剪切、高传质、营养成分的选择性渗入，使培养细胞和产物密度都可达到比较高的水平。缺点是膜的污染和堵塞，观察困难，细胞生长或过量气体产生会破坏纤维。该技术的发展趋势是让细胞在管束外空间生长，已达到更高的细胞培养液密度。目前，已开发由硅胶、聚砜、聚丙烯等材料构建的空心纤维培养系统。（4）微囊化：它的技术要点是在无菌条件将拟培养的细胞、生物活性物质及生长介质共同包裹在半透膜中形成微囊，再将微囊放入培养系统内进行培养。生长介质为1.4海藻酸钠溶液，半透膜由多聚赖氨酸形成。培养系统可采用搅拌式或七升式反应器系统。实验证明，采用批式和连续灌注式培养杂交瘤细胞生成单克隆抗体，在727天微囊内抗体浓度可达12505300mg/L.利用微囊包裹具有特定功能的组织细胞，形成免疫隔离的人工细胞，以此植入疾病动物或病人体内。它的优点在于：可防止细胞在培养过程中受到物理损伤；活性蛋白不能从囊中自由出入半透膜，从而提高细胞密度和产物含量。缺点是：微囊制作复杂，成功率不高；微囊内死亡的细胞会污染正常产物；收集产物必须破壁，不能实现生产连续化。五动物细胞培养的生物反应器1、生物反应器特点：动物细胞没有细胞壁，非常脆弱，对剪切力敏感，大多需要贴壁生长，因此传统的微生物发酵罐不适合于动物细胞培养，需要进行反应器结构改造以及特殊载体的选择。一般情况下，用于动物细胞培养的生物反应器应具备如下特点：混合系统设计应能提供均匀、温和的混合状态，剪切力小，保证良好的传质效果。反应器内空间利用率高，选用合适的载体系统和材料；能严格保证无菌环境。能精确地控制温度、酸碱度、溶解氧和CO2浓度等条件。能够方便、快捷地实现培养液的连续添加、样品的采样和观察。2、生物反应器类型：(1)搅拌式生物反应器搅拌式反应器靠搅拌桨提供液相搅拌的动力，它有较大的操作范围、良好的混合性和浓度均匀性，因此在生物反应中被广泛使用。但由于动物细胞没有细胞壁的保护，因此对剪切作用十分敏感，直接的机械搅拌很容易对其造成损害，传统的用于微生物的搅拌反应器用作动物细胞的培养显然是不合适的，所以，动物细胞培养中的搅拌式反应器都是经过改进的，包括改进供氧方式、搅拌桨的形式及在反应器内装辅件等。A、供氧方式的改进一般情况下，搅拌式反应器还常伴有鼓泡，为细胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪切也很敏感，所以人们在供氧方式的改进上做了很多工作。笼式供氧是搅拌式动物细胞反应器供氧方式的一种，即气泡用丝网隔开，不与细胞直接接触。反应器既能保证混合效果又有尽可能小的剪切力，以满足细胞生长的要求。北野招一报道了一个经过改进的搅拌式动物细胞反应器，整体呈梨形，搅拌至于反应器底部，在搅拌轴外装了一个锥形不锈钢丝网与搅拌轴一起转动，轴心处的鼓泡管在丝网与丝网内测鼓泡，丝网外侧的细胞不与气泡直接接触。B、搅拌桨的改进搅拌桨的形式对细胞生长的影响非常大，这方面的改进主要考虑如何减小细胞所受的剪切力。有人对搅拌桨的形式作了改进，并在反应器内加装了辅件，实验证明改进后的反应器适用于剪切力敏感的细胞进行高密度培养，反应器采用了一个双螺旋带状搅拌桨，顶部法兰盖上安装了3块表面挡板。每块挡板相对于径向的夹角为30，垂直插入液面挡板的存在减小了液面上的漩涡，这个反应器维持较小的剪切力，实验中用于昆虫细胞的培养，最终的培养密度达到6106个/ml,成活率在98以上。（2）非搅拌式生物反应器搅拌式生物反应器用于细胞培养存在的最大缺点是剪切力大，容易损伤细胞，虽然经过各种改进，这个问题仍很难避免。相比之下，非搅拌式搅拌器产生的剪切力较小，在动物细胞培养中表现出了较强的优势。A、填充床反应器填充是在反应器中填充一定材质的填充物，供细胞贴壁生长。营养液通过循环灌流的方式提供，并可在循环过程中不断补充。细胞生长所需的养分也可以在反应器外通过循环的营养液携带，因而不会有气泡伤及细胞，这类反应剪切力小，适合细胞高密度生长。B、中空纤维反应器其由于剪切力小而广泛用于动物细胞的培养。这类反应器由中空纤维管组成，每根中空纤维管的内径约为200um，壁厚为5070um.管壁是多孔膜，O2和CO2等小分子可以自由透过膜扩散，动物细胞贴附在中空纤维管外壁生长，可以很方便地获取氧气。C、气升式反应器有人在气升式反应器中利用微载体培养技术，研究了Vero细胞高密度培养的工艺条件。证明气升式反应器中悬浮微载体培养Vero细胞，在加入适量保护剂，营养供应充足的情况下，细胞可以正常生长至长满微载体表面，终度可达1.13106个/ml。六存在的问题与展望体外动物细胞培养中铵离子、乳酸和CO2的积累对细胞产生毒性作用或者改变细胞代谢水平，抑制细胞生长，需要及时改善培养环境。细胞凋亡是大规模细胞培养过程的重要制约环节，用基因工程方法将bcl-2基因这种细胞凋亡抑制基因导入细胞，成为众多研究者的选择。Bel-2基因的过量表达能抑制Gln或氧缺乏引起的细胞凋亡，减少细胞特定营养成分的消耗，提高细胞密度和目的蛋白产量，培养基中所添加的血清主要来源于动物或人，但存在潜在的污染源、不同批间蛋白含量差异大及价格高等缺点。有些细胞株依赖于血清源性生长因子的特性可通过分子遗传途径予以改变，即导入特异生长因子的基因，使细胞能合成自身的生长因子来满足细胞生长的需要，面对细胞生长无副作用。另外导入一些基因改变细胞圣战周期的调控也可使细胞在无血清蛋白培养基中生长。只要在培养基中增加某些适于细胞生长的成分，如纤连蛋白、转铁蛋白、胰岛素和表皮生长因子等，不少细胞既能在无血清供应的情况下生长，通过细胞工程方法使细胞高水平表达外源基因并正确加工表达产物，从而提高整个表达系统的产率，也成为应用大规模动物细胞培养生产外源目的基因的研究的重要手段，改善细胞环境是当前众多生物反应器及控制器研究者的不懈努力方向。随着对细胞生长和产物生长之间相关性研究的深入，对生物反应器更多培养状态参数的在线检测以及各种新细胞生物反应器系统的开发利用，新的培养控制模式将会在现有基础上不断产生。经过几十年的研究与实践应用，动物细胞培养技术已日趋完善，发展方向将集中在改进细胞特性优化细胞环境，扩大生产规模和提高目的产物与产量等几方面。(1)开发能高密度生长、能分泌大量目标产品的细胞系。(2)研制细胞生长性能优良、吸附细胞容易、解离细胞容易并能重复使用的新型微载体。 (3)研制规模化生物反应器，实时监测系统，剪切力小，、混合性能好的新型细胞培养系统和细胞培养与产物分离的耦合系统。(4)设计新的适合于各个体细胞株的无血清、无蛋白培养基，使生物制品更安全。(5)开展三维细胞培养及组织工程研究。参考文献：1.VanWezelA.LGrowthofcell-strainandpr