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第三章 外源褪黑素对离体培养的虎杖(Polygonum cuspidatum)生长的影响虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.)为多年生蓼科草本植物，主要分布于秦岭以南地区，根或根茎入药，其主要有效成分是芪类化合物和蒽醌类化合物，其中芪类化合物主要包括白藜芦醇和白藜芦醇苷。白藜芦醇及其苷类是一类具有多种药理作用的活性化合物，对癌变过程中细胞和组织变异的3个主要阶段(引发、增殖和发展)都具抑制作用，能够降血脂、抑菌、抗氧化、抗病毒、增强机体免疫力，还是一种安全的天然植物雌激素，广泛应用于临床医疗及保健业。对虎杖组织培养领域的相关报道也较少，本实验将MEL应用于虎杖的扦插培养研究，以揭示MEL对植物生长可能的调节作用。1 材料和方法1.1 材料虎杖外植体取自西北大学生命科学学院果园，经本校植物学专家鉴定为虎杖P.cuspidatum。取当年新生虎杖的带叶茎段，流水冲洗610h，经75%酒精处理1015 s，无菌水冲洗12次，再用0.2%升汞溶液消毒57min，无菌水冲洗34次，然后在无菌条件下剪掉叶片，剪成1cm长茎段（留一个腋芽），接种于MS培养基附加6-BA(0.1mg L-1)，GA3(1mg L-1)，IBA(0.5mg L-1)上进行培养。培养条件：温度252，相对湿度60%75%，人工光照1214 h.d-1，光照强度30molm-2s-1。8周后，再生出的无菌苗为实验材料。1.2 MEL和IAA处理从虎杖的无菌苗切取大约1cm长的茎段，保留一个腋芽，扦插在MS（加B5培养基的有机成分）培养基上。MEL和IAA过滤灭菌，以不同的终浓度(0，3moll-1，6moll-1，12moll-1和24moll-1)加在培养基中，先在252的暗环境下培养7天，然后在252，相对湿度60%75%，人工光照1214h.d-1，光照强度30molm-2s-1的环境下培养。分别在四周和六周后，测量根的长度和数量、茎的高度、叶的数量和叶面积。出根率(%)=出根外植体数/接种外植体数100%；根诱导密度=生根数/出根外植体数（于树宏等，2006）；平均根长=根总长/根总数平均茎高=总茎高/存活外植体数叶面积=总面积/存活外植体数1.3 统计分析每一个处理包括4个重复，每一个重复由5个外植体组成。实验重复3次。统计叶片数量和根的数量、测量根的长度和茎的长度。每个苗的每片叶面积用叶面积仪测量。以cm2表示。均值标准误被统计。所取数据经数理统计分析,各组处理间进行单因素方差分析.2 结果培养7-14天后，扦插于所有培养基上的茎段开始出现腋芽，茎开始延长，随后分化出根。培养6周后，MEL对离体培养虎杖生长的调节作用与相同浓度下的IAA进行统计和对比，图5显示了6moll-1MEL和6moll-1IAA影响离体扦插的虎杖茎段外植体根和芽生长的情况。附加低浓度的MEL与IAA的培养基上，苗的高度和叶面积总是高于对照组（即培养基中不加MEL与IAA）(图5.A1和A2，B1和B2，C1和C2)。图1和图2显示，6moll-1MEL和3moll-1IAA最有利于虎杖的生长，培养的虎杖茎的高度和叶面积都达到最大值。附加6moll-1MEL的培养基的平均苗高为7.63 1.45cm，平均每株苗叶面积达到29.710.1 cm2。浓度为3moll-1IAA的培养基上虎杖的茎高达到7.091.69cm，平均每株苗叶面积为31.86.55cm2。茎的高度和叶面积显著大于对照组（p0.05）。但是MEL和IAA的浓度升高时，茎和叶的生长均到抑制。24moll-1MEL和IAA表现出最强的抑制效应，在这个浓度下，附加MEL的培养基上茎高和叶面积与对照组没有显著差别，而附加IAA的培养基上茎高度和叶面积甚至低于对照组。相同浓度的MEL与IAA相比，MEL所诱导的叶面积虽然总是低于IAA诱导的叶面积，但是差异并没有达到显著性水平。图1 不同浓度MEL和IAA对扦插的苗高度的影响Fig.1 The effects of IAA or M E L at different concentrations on mean high of 6-week old shoots of Polygonum cuspidatum 图2 不同浓度MEL和IAA对扦插的虎杖苗叶面积的影响Fig.2 The effects of IAA or MEL at different concentrations on leaves area of per shoot of 6-week old shoots of Polygonum cuspidatum MEL和IAA都能诱导出丰富的根,然而，两者所诱导的根的形态差异极大（见图5.A3，B3和C3）。附加MEL的培养基上，茎段基部没有膨大，根数少而长，主根侧根形态明显，根的形态与没有附加任何激素的对照组所形成的根的形态极为相似。附加IAA的培养基上，茎段基部膨大，形成类似愈伤组织的结构，根数多但是很短，根上密被根毛,可见在所使用的浓度范围内，与相同浓度的IAA比较，MEL诱导所产生的根的长度显著大于IAA处理组（p0.01）（图4.），但是根数量显著低于IAA组(p0.01)（图3）。MEL和IAA的浓度与根的长度和数量之间也具有密切关系，低浓度的MEL和IAA促进根的生长，平均根数和根长达到最大值，随着MEL和IAA浓度的升高，根的数量和根长度会降低，高浓度的MEL和IAA对根的生长具有抑制作用。附加MEL的培养基上虎杖的根数和根长在MEL为6moll-1时达到最大值，平均根数为2.44 1.42个，根长度为2.79 1.20 cm。IAA浓度为3moll-1时，根的数量和根长度达到最大值，平均根数为6.63 3.46个，根长为0.95 0.27 cm。图3 不同浓度MEL和IAA对扦插的虎杖苗生根数的影响Fig. 3 The effects of IAA or MEL at different concentrations on mean number of adventitious roots of 6-week old shoots of Polygonum cuspidatum 图4 不同浓度MEL和IAA对扦插的虎杖苗根长度的影响Fig. 4 The effects of IAA or MEL at different concentrations on mean length of adventitious roots of 6-week old shoots of Polygonum cuspidatum另外，在附加MEL的培养基上培养，根产生的时间明显早于对照组和IAA处理组，很多茎段基部在接种1周后根开始萌动，而附加IAA的培养基上接种两周后才陆续分化出根，可是MEL诱导下的生根率总是低于IAA。图5 6M MEL和IAA对扦插的虎杖茎段生根和芽分化的影响(A1-A3):CK；(B1-B3):IAA；(C1-C3):MEL。Fig 5. Representative images of the root and shoot regeneration induced by 6M melatonin and indole-3-acetic acid (IAA) in 6-week-old shoots of Polygonum cuspidatumA1A3: CK; B1B3: IAA; C1C3: MEL.3 讨论培养基中附加植物生长调节物的浓度显著影响苗的生长和发育，与没有添加生长调节物的对照组相比，附加MEL和IAA的培养基上，芽生长健壮，叶片数多，根数多，或具有更长的根。在本实验中，相同浓度MEL与IAA的作用类似，均促进了虎杖茎和根的生长，且低浓度的促进效果更为明显。这一现象与外源MEL诱导羽扇豆下胚轴产生不定根（Arnao et al.,2007）以及MEL促进芥菜（Brassica juncea）根的生长得到的结果类似（Chen et al.,2009）。MEL具有生长素样的活性已在其它一些实验中发现（Murch et al.,2001；Arnao et al.,2007）。Chen等（2009）研究发现较低浓度的外源MEL提高了芥菜（Brassica juncea）内源IAA的含量，从而推测低浓度的MEL促进根的生长的原因是外源MEL激发内源IAA的合成；而高浓度时对植物生长表现的抑制效果可能是由于I