CTAB法枯草芽孢杆菌(Bacillus-subtilis)基因组DNA的提取.doc

CTAB法枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）基因组DNA的提取 内 容 提 要以枯草芽孢杆菌为材料，采用CTAB法（十六烷基三甲基溴化铵）提取枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的基因组DNA作为基因扩增的模板，并测定其含量和纯度。本实验要求：提取高质量的基因组DNA为下一步的基因操作准备。原 理高纯度、高分子量的基因组DNA是构建基因组文库、Southern 杂交(包括RFLP)及PCR等后续的分子生物学操作的基础。利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA 即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA 则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA 时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb 以上，否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP 和PCR 分析, DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下)，并可保证包含PCR 所扩增的片段(一般2kb 以下)。不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同；不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA 大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR 反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA 时, 应考虑除去多糖和酚类物质。DNA的含量与纯度在研究工作中十分重要，常常需要测定。目前使用较多和较简便的是紫外吸收法。核酸在260nm波长有一特征吸收峰，根据其光密度（OD）值可计算DNA浓度。蛋白质在260nm波长处有一特征吸收峰，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，因此当核酸样品中蛋白质含量较低时，对核酸的紫外测定影响不大。DNA的260nm与280nm吸收比值在1.8左右，当制品中蛋白质含量较高时此比值下降，比值大于2时表明RNA及核酸碎片多，比值在1.8-1.99表明纯度较好。一、主要仪器、材料、和试剂1. 仪器移液器，高速冷冻离心机，台式离心机，水浴锅，紫外可见分光光度计。2. 实验材料枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）3. 试剂. CTAB/NaCl 溶液：4.1g NaCl 溶解于80ml H2 O，缓慢加入10g CTAB，加水至100ml。. 氯仿：异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE（10mMTris-HCl ， 1mMEDTA, pH8.0），10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml 或粉剂)，5mol/L NaCl。二、操作步骤1. 取100ml过夜培养的菌液，5000 rpm 离心10分钟，弃上清液。2. 菌体沉淀用10 ml TE 悬浮，并加0.5ml 10% SDS，50l蛋白酶 K，混匀，37保温1小时。3. 加1.5ml 5mol/L NaCl，混匀。再加1.5ml CTAB/NaCl 溶液，混匀，65保温20 分钟。4. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) 抽提，5000rpm 离心10 分钟，移取上清液至干净离心管。5. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提，取上清液移至干净管中。6. 加1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止10分钟，10 000rpm离心15分钟得到DNA沉淀。7. 加入700l 70%乙醇，70l 3M NaAc漂洗DNA沉淀，溶解于1ml TE，-20保存。8. 去除RNA：加5l RNase 加1/10体积3M NaAc加2倍体积无水乙醇10分钟后，将DNA沉淀溶于1ml TE，-20保存。9. 用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。10用分光计测定浓度及纯度：产品DNA溶液用TE缓冲液适当