反转录病毒 课件.ppt

逆转录病毒Retroviruses 1 医学交流课件 逆转录病毒 Retroviruses 归类于逆转录病毒科 包括一大类含有逆转录酶的RNA病毒 分为肿瘤病毒亚科 Oncovirinae 慢病毒亚科 Lentivirinae 和泡沫病毒亚科 Spumavirinae 每一亚科又有若干个属 2 医学交流课件 逆转录病毒的分类 3 医学交流课件 逆转录病毒共同的生物学特性 病毒呈球形 有包膜 直径80 120nm 病毒基因组由两条相同的单正链RNA形成的二聚体组成 病毒的核心含有逆转录酶 RNA水解酶和整合酶 复制有一个独特的逆转录和与宿主细胞的整合过程 病毒基因组RNA先逆转录成双链DNA 然后整合到宿主细胞的染色体DNA中 具有gag pol和env3个结构基因 4 医学交流课件 第一节人类免疫缺陷病毒1981年美国疾病控制中心科学家发现获得性免疫缺陷综合症 1983年法国巴斯德研究所Montagnier等首次从一例慢性淋巴腺病的男性同性恋病人血液中分离到的一株新逆转录病毒 称为淋巴腺病相关病毒 LAV 1984年 美国Gallo等亦从艾滋病人中分离到相似的逆转录病毒 称之为人类嗜T淋巴细胞病毒 型 HTLV 1986年 国际病毒分类委员会将LAV HTLV 统一命名为人类免疫缺陷病毒 humanimmunodeficiencyvirus HIV 5 医学交流课件 HIV是获得性免疫缺陷综合征 acquiredimmunodeficiencysyndrome AIDS 的病原体 HIV分HIV 1型和HIV 2型 前者引起全球AIDS流行 后者主要分离自西部非洲的艾滋病患者 我国自1985年发现首例AIDS以来 感染人数逐年快速增长 6 医学交流课件 根据编码包膜蛋白的env基因和编码壳蛋白的gag基因序列的同源性 HIV 1型又进一步分为3个组 M亚型组 main即主要组 O亚型组 outline即外围组 和N亚型组 new ornon M non O新组或非M非O组 其中M组有A B C D E F G H I J K11个亚型 O组是1990年从喀麦隆和加蓬分离到的 与M组其他亚型的氨基酸序列只有50 的同源性 N组是最近才从两名喀麦隆病人分离到的 在系统树上 既不属于M组 也不属于O组的一组新病毒 故称N组 7 医学交流课件 不同组甚至不同亚型在全球流行是不均一的 HIV 1的O组 N组和HIV 2型只局限在非洲某些局部地区流行 而HIV 1的M组病毒呈全球性流行 到目前为止 全球流行的绝大多数毒株是HIV 1M组中的A C亚型毒株 接着是B亚型毒株 然后是A E和A G亚型重组毒株 进一步的分子流行病调查表明 在非洲几乎流行了HIV的所有亚型 但以A和C亚型为主 8 医学交流课件 HIV 1型M亚型组A B C D E F G H I J K共11个亚型O亚型组N亚型组HIV 2型A B C D E F G共7个亚型 9 医学交流课件 一 生物学性状HIV为20面体对称结构 球形 电镜下可见一致密圆锥状核心 内有病毒RNA分子和酶 逆转录酶 整合酶和蛋白酶 HIV的最外层为脂蛋白包膜 膜上有表面蛋白 gp120 和镶嵌蛋白 gp41 两种糖蛋白 gp120为刺突 gp41为跨膜蛋白 包膜内面为P17构成的基质蛋白 其内为衣壳蛋白 P24 包裹的RNA 10 医学交流课件 HIV结构模式图 11 医学交流课件 HIV基因组由两个拷贝的正链单股RNA组成 在其5 端可通过氢键结合构成二聚体 HIV的基因组成较其他逆转录病毒复杂 全长约9 2kb 含有gag pol和env三个结构基因 以及tat rev nef vif vpr和vpu等调控基因 12 医学交流课件 HIV的复制过程 首先借助其包膜糖蛋白刺突gp120 与易感细胞表面的CD4分子结合并进一步介导包膜与宿主细胞膜的融合 核衣壳进入细胞 于胞质内脱壳释放出RNA 13 医学交流课件 HIV LifeHistory EntryintothecellT4 CD4 cellsaremajortarget HumanHeLaCell HumanHeLaCelltransfectedwithCD4antigen NOTINFECTED INFECTED 14 医学交流课件 CD4 cell HIVgp120bindstoCD4 co receptor 15 医学交流课件 HIV LifeHistory CD4 CD4 CD4 HIV CCR5 CCR5 chemokine MutantCCR5 macrophage 16 医学交流课件 HIV复制 在病毒逆转录酶和病毒体相关的DNA多聚酶的作用下 病毒RNA先逆转录成cDNA 构成RNA DNA中间体 其中的RNA再经RNA酶H水解 而以剩下的负链DNA复制成双股DNA 插入宿主DNA 成为细胞染色体的一部分 即前病毒 当前病毒活化 在宿主RNA聚合酶的作用下 病毒的DNA转录为RNA并分别经拼接 加帽或加尾形成HIV的mRNA或子代病毒RNA mRNA在宿主细胞核糖体上翻译蛋白质 子代RNA则与病毒结构蛋白装配成核衣壳 从宿主细胞释出时获得包膜 成为具有感染性的子代病毒 17 医学交流课件 18 医学交流课件 HIV的变异HIV具有高度变异性 主要取决于env nef ltr及pol等基因 不同病毒株间在上述基因的变异率各不相同 env基因编码包膜糖蛋白抗原 此类抗原的变异与HIV的流行和逃避宿主的免疫应答密切相关 根据env基因序列的不同 将国际上流行的HIV 1分为M N和O群 其中M又有A K等11个亚型之分 19 医学交流课件 培养特性在体外 HIV只感染CD4 T细胞和巨噬细胞 新鲜分离的正常人T细胞 病人自身分离的T细胞培养或某些T细胞株 感染后细胞出现不同程度的病变 培养液中可测到逆转录酶活性 而培养细胞中可查到病毒的抗原 动物接种 恒河猴 黑猩猩 20 医学交流课件 二 致病性与免疫性1 传染源 HIV携带者和艾滋病患者2 传播途径 性接触传播 输血或血制品传播 母 婴垂直传播 21 医学交流课件 3 致病机制 1 损伤CD4 细胞 以CD4 细胞为中心的免疫功能全面障碍 其他细胞损伤 如单核 巨噬细胞 小神经胶质细胞等 2 其他免疫细胞功能异常 CD4 细胞是重要的免疫调节细胞 其数量和功能的改变都将影响其他免疫细胞的状态 3 HIV具有高度变异性 影响机体抗感染免疫和疫苗的研究 22 医学交流课件 1 PUNCTUREDMEMBRANE 1 病毒增殖导致胞膜通透性增加 23 医学交流课件 UninfectedCD4cellgp120negative CellsFuse 2 形成多核巨细胞而导致细胞死亡 InfectedCD4cellgp120positive WhydoallT4cellsdisappear 24 医学交流课件 3 损伤CD4 T细胞 WhydoallT4cellsdisappear 25 医学交流课件 4 临床特征 1 原发感染急性期 2 无症状潜伏期 3 AIDS相关综合征期 4 典型AIDS期 AIDS的诊断标准已由CDC确定 26 医学交流课件 感染艾滋病毒的早期症状1 艾滋病一般性症状持续发烧 盗汗 虚弱 全身浅表淋巴结肿大 体重下降在三个月之内可达10 以上 最多可降低40 病人消瘦特别明显 2 消化道症状食欲下降 厌食 恶心 呕吐 腹泻 严重时可便血 通常用于治疗消化道感染的药物对这种腹泻无效 3 神经系统症状头晕 头痛 反应迟钝 智力减退 精神异常 抽风 偏瘫 痴呆等 4 皮肤和粘膜损害弥漫性丘疹 带状疱疹 口腔和咽部粘膜炎症及溃烂 5 肿瘤可出现多种恶性肿瘤 位于体表的卡波希氏肉瘤可见红色或紫红色的斑疹 丘疹和浸润性肿块 27 医学交流课件 因此建议在高危行为的6周或三个月后去做HIV抗体检测 只有在艾滋病病毒感染的潜伏期 发现艾滋病病毒感染才有可能治疗并控制病情发展 否则一旦发展为艾滋病病人 就很难挽回了 28 医学交流课件 CD4细胞 l 10005002502001000 41015年 500 250 250 100 淋巴结肿口腔白斑白色念珠菌感染带状疱疹结核PcPKaposi肉瘤消耗病弓形体病CMV感染非典型分枝杆菌淋巴瘤 CD4 T细胞进行性下降与并发症之间的关系 29 医学交流课件 5 免疫性在HIV感染过程中 机体可产生高效价的抗HIV多种蛋白的抗体 包括抗gp120的中和抗体 这些抗体主要在急性期降低血清中的病毒抗原数量 但不能清除细胞内病毒 HIV感染也可引起细胞免疫应答 包括特异性CTL和非特异性NK细胞的杀伤作用 其中CTL对HIV感染细胞的杀伤十分重要 但也不能彻底清除潜伏感染的病毒 30 医学交流课件 三 微生物学检查法1 检测特异性抗体检查血清中抗gp120的抗体 可用ELISA IFA RIA 适用于筛查 HIV的gpl20与淋巴细胞膜上的MHC 类分子有同源区 所以会出现假阳性反应 检出阳性标本 再用蛋白印迹法 westernblottest 等方法复核确诊 2 病毒分离培养敏感细胞有T淋巴细胞株 新鲜分离的正常人淋巴细胞 31 医学交流课件 HIV抗体筛查检测流程 32 医学交流课件 3 病毒抗原测定常用ELISA法检测HIV的核心蛋白P24 此抗原特异性高 常出现于急性感染期 而在潜伏期常为阴性 但发展为AIDS时 P24抗原又可重新升高 4 测定病毒核酸 1 原位杂交 2 RT PCR 3 病毒载量5 CD4 T细胞计数 33 医学交流课件 四 防治原则1 非医疗措施 广泛开展宣传教育 普及AIDS的传播途径和预防知识 建立和加强对HIV感染的监测体系 加强进出口管理 严格国境检疫 对供血者作HIV及其抗体检测 保证血源的安全性 34 医学交流课件 2 疫苗研制新一代疫苗的必要条件安全性 产生CTL反应和抗体反应 以本地流行毒株组分为主 包含尽可能多的抗原决定簇 避免带有可能诱发增强抗体和自身免疫反应的组分 难题是病毒包膜蛋白的高度变异性 35 医学交流课件 3 抗病毒药物治疗抗HIV的药物包括三大类 核苷类药物 非核苷类药物 蛋白酶抑制剂联合交替使用 三合一 2种HlV逆转录酶抑制剂和1种蛋白酶抑制剂即所谓 鸡尾酒疗法 可有效抑制病毒在体内的复制 因而能减轻病人症状及延长感染者和病人的生命 36 医学交流课件 4 治疗措施抗病毒治疗机会感染重建免疫功能抗肿瘤 37 医学交流课件 举例 HIV AIDS的实验室检查 HIV AIDS的实验室检测主要包括 HIV抗体 HIV核酸 CD4 T淋巴细胞 HIV基因型耐药检测等 HIV1 2抗体检测是HIV感染诊断的金标准HIV核酸定量 病毒载量 检测和CD4 T淋巴细胞计数是判断疾病进展 临床用药 疗效和预后的两项重要指标HIV基因型耐药检测可为高效抗反转录病毒治疗方案的选择和更换提供科学指导 38 医学交流课件 HIV1 2抗体检测筛查试验 含初筛和复检 酶联免疫吸附试验 ELISA 化学发光或免疫荧光试验快速检测 斑点ELISA和斑点免疫胶体金或胶体硒快速试验明胶颗粒凝集试验 免疫层析试验 HIV1 2抗体检测确证试验常用的方法 免疫印迹法 WB 39 医学交流课件 人类免疫缺陷病毒 HIV1 2 抗体诊断试剂盒 胶体金法 说明书 本试剂是根据免疫学金标法 双抗原夹心和免疫层析原理制成 先在硝酸纤维膜上包被基因重组HIV1 2型抗原 EnV16 再在玻璃纤维上吸附胶体金标记的HIV重组抗原 EnV18 组合制成试纸条 检测时样品中如有抗HIV抗体 则与胶体金标记的基因重组 HIV 1 2型抗原蛋白 Ag Au 形成复合物 由于层析作用复合物沿膜带移动 与检测区包被的基因重组 HIV 1 2型抗原形成双抗原夹心免疫复合物 呈现一条红色线 即可判定为HIV抗体阳性 如样品中无抗HIV抗体 则无此反应 显示阴性结果 该方法可用于检测人血清或血浆中的HIV1 2型抗体 适用于无偿献血的现场筛查 产品组成1 HIV1 2抗体诊断试纸条50人份2 说明书1份标本采集标本为血清样品 按临床常规方法采集 使用方法1 从袋中取出试纸条 于非样品端作好标记 2 于试纸条的样品端滴加2滴样本 约100微升 亦可将试纸条浸于样本液中 注意液面不能超过标志线 否则检测结果无效 3 反应30分钟判定结果 结果判断阳性 可见两条紫红色区带显色 既反应线 T 和质控线 C 阴性 仅见一条紫红色区带 即质控线 C 显色 无效 无任何色线出现或仅反应带显色 应换新试纸条重测 40 医学交流课件 筛查试验阴性 可出具HIV1 2抗体阴性报告见于未被HIV感染的个体但处于窗口期的新近感染者也可呈阴性反应 41 医学交流课件 筛查试验 阳性 应用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的试剂进行重复检测或另外两种不同原理或不同厂家的试剂进行重复检测如两种试剂复测均呈阴性反应 则为HIV抗体阴性如有一种或两种试剂呈阳性反应 需进行HIV抗体确证试验 42 医学交流课件 确诊试验 出现HIV1 2抗体特异带 但不足以判定阳性 报告HIV1 2抗体不确定 可在4周后随访 如带型没有进展或呈阴性反应 则报告阴性如随访期间发生带型进展 符合HIV抗体阳性判定标准则为HIV抗体阳性如带型仍不满足阳性标准 继续随访到8周 如带型没有进展或呈阴性反应则报告阴性 43 医学交流课件 确诊试验 满足HIV阳性诊断标准则报告阳性 不满足阳性标准可视情决定是否继续随访经确证试验HIV 1 2抗体阳性者 出具HIV 1 2抗体阳性确认报告 并按规定做好咨询 保密和报告工作 44 医学交流课件 实验室检查 病毒载量测定 病毒载量一般用血浆中每毫升HIVRNA的拷贝数 copies ml 或每毫升国际单位 IU ml 来表示 45 医学交流课件 实验室检查 病毒载量测定 病毒载量测定常用方法反转录PCR系统 RT PCR 核酸序列依赖性扩增 NASBANucliSens 技术分枝DNA信号放大系统 bDNA 实时荧光定量PCR扩增技术 real timePCR 46 医学交流课件 实验室检查 病毒载量测定 病毒载量测定的临床意义预测疾病进程提供开始抗病毒治疗依据作为HIV感染早期诊断的参考指标小于18月龄的婴幼儿HIV感染诊断可以采用核酸检测方法 以2次核酸检测阳性结果作为诊断的参考依据18月龄以后再经抗体检测确认 47 医学交流课件 实验室检查 病毒载量测定 推荐病毒载量检测频率对于已接受抗病毒治疗6个月以上 病毒持续抑制的患者 可每6个月检测一次 HAART治疗6个月内或病毒载量抑制不理想或需调整治疗方案时病毒载量的检测频率需根据患者的具体情况由临床医生决定 如条件允许 建议未治疗的无症状HIV感染者每年检测一次 ART初始治疗或调整治疗方案前 初治或调整治疗方案初期每4 8周检测一次 以便尽早发现病毒学失败 病毒载量低于检测下限后 每3 4个月检测一次 对于依从性好 病毒持续抑制达2 3年以上 临床和免疫学状态平稳的患者可每6个月检测一次 48 医学交流课件 CD4 T淋巴细胞检测 CD4 T淋巴细胞是HIV感染最主要的靶细胞 HIV感染人体后 出现 CD4 T淋巴细胞进行性减少CD4 CD8 T细胞比值倒置现象细胞免疫功能受损进行HAART治疗 CD4 T淋巴细胞在病程的不同阶段可有不同程度的增加 49 医学交流课件 目前常用的CD4 T淋巴细胞亚群检测方法为流式细胞术可以直接获得CD4 T淋巴细胞数绝对值或通过白细胞分类计数后换算为CD4 T淋巴细胞绝对数如果进行HAART治疗 CD4 T淋巴细胞在病程的不同阶段可有不同程度的增加 50 医学交流课件 CD4 T淋巴细胞计数的临床意义是了解机体的免疫状态和病程进展确定疾病分期和治疗时机判断治疗效果HIV感染者的临床合并症 51 医学交流课件 CD4 T淋巴细胞计数的检测间隔时间需根据患者的具体情况由临床医生决定一般建议对于CD4 T淋巴细胞数 350 mm3的HIV无症状感染者 每6个月应检测一次对于已接受ART的患者在治疗的第一年内应每三个月进行一次CD4 T淋巴细胞数检测 治疗一年以上且病情稳定的患者可改为每半年检测一次 52 医学交流课件 HIV基因型耐药检测 HIV耐药检测结果可为艾滋病治疗方案的制定和调整提供重要参考 耐药测定方法有基因型和表型 目前国外及国内多用基因型推荐在以下情况进行HIV基因型耐药检测抗病毒治疗病毒载量下降不理想或抗病毒治疗失败需要改变治疗方案时如条件允许 进行抗病毒治疗前 最好进行耐药性检测 以选择合适的抗病毒药物 取得最佳抗病毒效果对于抗病毒治疗失败者 耐药检测需在病毒载量 1000拷贝 ml且未停用抗病毒药物时进行 如已停药需在停药4周内进行基因型耐药检测 53 医学交流课件 HIV基因型耐药检测 HIV基因型检测出现HIV耐药表示该感染者体内病毒可能耐药 同时需要密切结合临床 充分考虑HIV感染者的依从性 对药物的耐受性及药物的代谢吸收等因素综合进行评判改变抗病毒治疗方案需要在有经验的医师指导下才能进行HIV耐药结果阴性抗表示该份样品通过基因型耐药检测未检出耐药性 不能确定该感染者不存在耐药情况 54 医学交流课件 我国抗病毒治疗面临的挑战 整体治疗水平低 监测能力受限制药物种类少 长期治疗的毒副作用越来越突出特殊人群的治疗 HCV HBV TB 孕妇 儿童 病毒耐药带来更大的治疗困难 55 医学交流课件 56 医学交流课件 核苷类药物被细胞编码的磷酸激酶作用后 掺入子代病毒DNA中造成病毒基因组缺陷 不能正常进行复制和转录 叠氮胸苷Zidovudine AZT 齐多呋定用于治疗艾滋病获得性免疫缺陷综合征 病人有合并症 卡氏肺囊虫病或其他感染 时尚需应用对症的其他药物联合治疗 成人常用量 次 每 小时 次 按时间给药 有贫血的病人 可按 次 给药 57 医学交流课件 国际上现有的抗反转录病毒药物 核苷类似物AZT zidovudine Retrovir叠氮胸苷ddI didanosine VidexEC地达诺新ddC zalcitabine Hivid扎西他宾d4T stavudine Zerit司他夫定3TC lamivudine Epivir拉米夫定abacavir Ziagen阿巴卡韦FTC emtricitabine Emtriva恩曲他滨8 tenofovir Viread泰诺福韦 58 医学交流课件 非核苷类反转录酶抑制剂 9 delavirdine Rescriptor地拉韦啶10 nevirapine Viramune奈韦拉平11 efavirenz Sustiva依法韦仑12 etravirine Intelence依曲伟林 59 医学交流课件 13 indinavir Crixivan r茚地那韦14 saquinavirInvirase