微生物蛋白的提取和分离纯化.ppt

微生物中蛋白的分离纯化 用途 药物 多肽饲料 菌蛋白工业 酶 单细胞蛋白具有较门的营养价值 茵体中蛋白质可达40 60 其中氨基酸组份齐全 生物效价较高 相当于酪蛋白 为70左右 而且赖氨酸等必需氨基酸含量较高 还具有丰富的维生素 可以作为维生案的补给品 按其所发挥的功能把小肽分为两大类 即功能性小肽和营养性小肽 功能性小肽指能参与调节动物的某些生理活动或具有某些特殊作用的小肽 如抗菌肽 免疫肽 抗氧化肽 激素肽 表皮生长因子等 营养性小肽是指不具有特殊生理调节功能 只为蛋白质合成提供氮架的小肽 目前 生物界已发现的酶有数千种 用微生物发酵法生产的酶有上百种 工业化生产的酶制剂 按用途不同可分为工业用酶和医药用酶两大类 前者一般不需纯制品 而后者要求的纯度较高 其价格是前者的数千倍至数百万倍 由微生物生产的工业用酶制剂主要有糖化酶 淀粉酶 转化酶 异构酶 半乳糖酶 纤维素酶 蛋白酶等 医药用酶主要有蛋白酶 胃蛋白酶 胰蛋白酶 核酸酶 脂肪酶 尿激酶 链檄酶 天冬酰胶酶超氧化物歧化酶 溶菌酶 血溶栓酶等等 蛋白质的分离纯化步骤 1 生物组织的机械破碎 2 抽提 根据蛋白质的特性 选择不同的溶剂进行抽提 水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提 酸性蛋白用稀碱性溶液抽提 脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等 3 粗提 用离心法除去固体杂质后 可通过沉淀法 膜分离法 萃取法等处理 得到蛋白质粗制品 4 精制 可用层析法 电泳法进行精制 5 成品加工 测定蛋白质的性质并干燥成成品 根据所需的目的蛋白制定蛋白提取和纯化的策略和步骤一般的预处理 过滤 工业生产 和离心 实验室研究 预处理 菌体表达的胞外酶 上清 滤液 沉淀 滤饼 菌体表达的胞外酶分解培养基形成的小肽及一些氨基酸成分 未分解利用的部分培养基 菌体 胞内匀浆 胞内表达的酶 小肽 膜系结构 周质蛋白 膜蛋白 细胞破碎和蛋白质溶解 机械法匀浆 研磨 压榨 超声等非机械法渗透 酶溶 冻融 化学等新方法激光破碎 冷冻喷射 相向流撞击等 胞外酶 取预处理后的上清液 滤液 根据目的蛋白的相关性质 采用相关的方法提取纯化目的蛋白 举例 壳聚糖酶高产菌株的筛选 产酶条件的优化及壳聚糖酶的分离纯化 粗酶液 加入50 PEG6000至终浓度为5 4 静置2h 4000rpm离心 取上清 20 预冻15min 加入等体积 20 的丙酮 混匀 20 静置2h 4000rpm离心 取沉淀 加入少量乙醚 4 真空干燥 溶于醋酸缓冲液中 10000rpm冷冻离心 收集上清 DEAE SepharoseFF层析 中等碱性 阴离子交换树脂 CM一SephaorseFF层析 弱酸性 阳离子交换树脂 Supedrex一75层析 分子筛柱 SDS PAGE电泳 透析后浓缩 调节pH至5 6 酶活检测 层析过程 1 装柱 2 平衡 equilibrium 3 上样 loading 4 洗涤 washing 5 洗脱 elution 6 清洗与再生 离子交换柱特点 料液处理量大 在适宜的操作条件下 分离过程具有浓缩作用 分辨率较高 优化操作条件可大幅度提高分离的选择性 所需柱长较短可在较高流速下操作 吸附作用机理明确 非特异性吸附小 产品回收率高 离子交换剂种类多 选样余地大 价格也远低于亲和吸附剂 层析条件 离子强度 pH值 流速等 主要影响样品中组分和离子交换剂的带电性质 一般来说 pH对弱酸和弱碱型离子交换剂影响较大 如对于弱酸酸型离子交换剂在pH较高时 电荷基团充分解离 交换容量大 而在较低的pH时 电荷基团不易解离 交换容量小 同时pH也影响样品组分的带电性 离子强度增大 交换容量则下降 实验中增大离子强度进行洗脱 就是要通过降低交换容量把结合在离子交换剂上的样品组分洗脱下来 离子交换柱层析的操作要点 1 平衡缓冲液2 上样3 洗脱缓冲液4 洗脱速度 要保证各个待分离物质 如蛋白质 的稳定 要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合 并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别 另外注意平衡缓冲液中不能含有与离子交换剂结合力强的离子 否则会大大降低交换容量 影响分离效果 离子交换层析上样时应注意样品液的离子强度和pH值 上样量应根据柱内离子交换剂的交换容量决定 不宜过大 从而得到较好的分离效果 首先要保证在整个洗脱液梯度范围内 所有待分离组分都是稳定的 其次是要使结合在离子交换剂上的所有待分离组分在洗脱液梯度范围内都能够被洗脱下来 洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离效果 洗脱速度通常要保持恒定 一般洗脱速度慢比快的分辨率要好 但洗脱速度过慢会造成分离时间长 样品扩散 谱峰变宽等副作用 所以要根据实际情况选择合适的洗脱速度 如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠 则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率 如果分辨率较好 但洗脱峰过宽 则可适当提高洗脱速度 洗脱 按操作方式A 恒定洗脱 isocraticelution B 分步洗脱 stageelution C 梯度洗脱 gradientelution 凝胶柱特点 特点 1 介质不带电荷 具有化学惰性 不与被分离物质发生化学反应 条件温和 不会使物质变性 2 色谱介质不需再生 可反复便用 3 分离效率高 回收率较高 4 广泛应用于生物大分子的初级分离 脱盐等 5 分辨率较低 需采用细长柱 6 经过凝胶过滤色谱后样品被稀释 上样前需进行浓缩 Sephaery1S一200HR层析SephacrylHighResolution 即SephacrylHR 系列凝胶 是由烯丙基葡聚糖通过N N 亚甲基双丙烯酰胺交联而成 凝胶的网孔特性由葡聚糖组分来控制 形成分级范围不同的五种类型 S100 500HR 其中 数字越大 孔径越大 特点 介质的颗粒尺寸分布较窄 柱效高 9000塔板数 米 在机械强度 理化特性 化学稳定性及热稳定性等方面均优于传统凝胶介质由于其机械强度高 适合在高流速下进行快速分离 可以用0 5mol LNaOH作为清洗剂在pH7时能承受121 30min反复高温灭菌而不会对层析效果产生明显影响其分离效果不受去污剂 促溶盐类 变性剂等影响能在多种有机溶剂存在下使用 Supedrex 75层析柱 Superdex系列凝胶 是将葡聚糖与高交联度的琼脂糖颗粒共价结合而形成的 其中 琼脂糖基质决定了凝胶具有高度的理化稳定性 而葡聚糖链决定了凝胶的层析特性 根据分级范围不同 可分为若干型号 其中 数字越大 孔径越大 prepgrade颗粒较大 SuperdexpeptideSuperdex30prepgradeSuperdex75 200 prepgrade Superdex系列凝胶是目前分辨率和选择性最高的凝胶介质之一颗粒尺寸很小 大小分布均匀 填充成层析柱后柱效非常高 最高可达30000塔板数 米 即使在很高的流速下仍能获得非常高的分辨率 在机械性能 化学稳定性及热稳定性等方面均大大优于传统凝胶介质 凝胶过滤层析的操作过程 1 凝胶的选择2 装柱3 平衡 equilibrium 4 上样 loading 5 洗脱 elution 6 凝胶再生和保养 平衡缓冲液应与洗脱缓冲液相同缓冲液种类 pH 离子强度和添加剂的选择应根据溶液与基质的相互作用 可溶性和样品的生化性质 以及后续操作的要求等选择 使用前通过0 45 m的膜过滤 可防止不溶性小颗粒堵塞柱子 平衡体积至少为5倍床体积 样品集中上样后 加洗脱液 防止返混 洗脱液成份应与膨胀胶和平衡时所用的液体相同 层析结果见图 分别收集峰 测定酶活 其中A峰活性最高 占上样总活性的85 14 因此收集峰A 进行下一步层析 层析结果见图 采用步进式洗脱 收集各个峰 测定酶活力 其中峰b酶活最高 占上样总活力的8 534 因此收集峰b 浓缩后进行下一步层析 发现峰A酶活最高 占总活活力的47 44 通过SDS一PAGE检测显示为单带 析结果见图 层析图表明样品仅有一个单峰 结合SDS PAGE结果 可以证明贵州绿僵菌AS3 4608所产壳聚糖酶是单亚基蛋白 在蛋白质纯化的起始阶段 合适的粗分离手段能大大降低后续操作的难度 在传统的粗分离方法中 实验室一般采用盐析 如硫酸铵 分段沉淀 使用该法蛋白质不易失活 但是操作体积较大 后处理麻烦 不能直接进行离子交换层析 需要进行脱盐处理 如透析或小孔径分子筛层析 不适宜工业生产 工业上一般采用有机溶剂 如丙酮 乙醇 沉淀 该法分辨率较高 沉淀速度快 能够起到浓缩蛋白质溶液的目的 且能够降低盐浓度 但是该法易使蛋白质失活 样品活力损失较大 目前还有一种粗沉淀蛋白质的方法是采用如EPG等高分子物质沉淀蛋白质 高分子溶液能够维持蛋白质构像 使蛋白质不易变性 但是一般使用高分子沉淀蛋白质分辨率较低 不适合采用分级沉淀的方法来达到粗分离的目的 而且沉淀蛋白质所需浓度的高分子溶液 如30 的PEG一6000 表观粘度一般较大 给分离沉淀操作带来不便 本研究向粗酶液中加入PEG6000至终浓度为5 可以沉淀部分杂蛋白 由于PEG的絮凝作用 可以使难以除去的小颖粒都聚集在一起自然沉降下来 这一点通过加入PEG后粗酶液明显分层且上清液很澄清即可看出 另一方面 PEG能够在丙酮沉淀过程中保护蛋白质 同时PEG能降低溶液的冰点 因而可以将蛋白质溶液放入一20 中预冻而不会结冰 在加入冷丙酮沉淀蛋白的过程中可以进一步降低沉淀时的温度 减小因为蛋白质变性带来的活性损失 由于PEG溶于丙酮 大多数PEG通过离心随上清液除去 余下留在沉淀中的少量EPG也可以通过离子交换层析除去 由于提取液中的盐离子浓度较低 粗分离中也没有引入高盐浓度的溶液 因此沉淀蛋白质溶解后可以直接进行离子交换层析 而不需要脱盐 如何选择合适的层析条件 加快层析速度 简化操作 增加收率一直是蛋白质分离纯化的重点和难点 采用阴离子交换树脂 吸附目标蛋白质需要较高pH 而壳聚糖酶在高HP环境中不稳定 而单独采用阳离子交换树脂虽然可以轻易将壳聚糖酶吸附 但是大量杂蛋白和色素随之结合在层析柱上 采用KCl溶液洗脱时回不仅使大量难以脱去的色素随目标蛋白洗脱下来 给分子筛层析纯化带来困难 同时易产生层析柱的堵塞 降低层析速度 鉴于这种情况 本研究采用了阴 阳离子层析联合使用的方法 先将样品液通过阴离子交换树脂 通过反吸附除去大量色素和酸性杂蛋白 而通过控制pH使目标蛋白质基本不与阴离子交换树脂结合 随后将穿透峰液体上样阳离子交换树脂 目标蛋白能够被阳离子柱吸附 通过阳离子树脂的吸附 实际上可以起到将大体积的样品液浓缩的作用 同时采用的步进式洗脱方式 用KCl溶液洗脱下来都是己经浓缩的酶液 可以减轻分子筛柱前对样品高度浓缩的压力 小肽 来自于微生物胞内或胞外的小肽大多为小肽混合液 小肽的分离建立在各种小肽不同分子量的基础上 即初步的膜过滤后再进行细化的凝胶过滤等分离手段进行分离纯化 将预处理后的上清液分别通过三种超滤膜进行分离 分别获得分子量 20000 20000 10000 10000 6000 60004个肽段 根据所需的分子量范围选择相应的凝胶柱进行凝胶过滤层析 以分离目的小肽 超滤分离 凝胶过滤 SDS PAGE电泳 确定所分离的小肽的分子量 酿酒酵母胞内无机焦磷酸酶的分离纯化 发酵液 收集菌体 蒸馏水洗涤三次 pH7 5Tris HCl缓冲液洗涤两次 离心 取沉淀 加Ph7 5 Tris HCl缓冲液悬浮 冰浴 超声波破碎10min 10000r min离心30min 冰浴上清 加 NH4 2SO4使其饱和度达到50 放置6h 离心取上清 上清液继续加 NH4 2SO4使其饱和度为80 放置过夜 离心取沉淀 用pH7 5Tris HCl缓冲液溶解 得粗酶液 DEAE 纤维素柱层析 SDS PAGE电泳 酶活检测 无机磷酸酶参与多种代谢途径中的焦磷酸的水解作用 该酶在DNA和RNA聚合反应 辅酶的合成 氨基酸和脂肪酸活化等反应过程中都起着重要的作用 粗酶液先对水透析 再对50mmol LTris HCl透析 上DEAE 纤维素 DE 52 柱 上样前先用50mmol LTris HCl平衡 上样后 先用相同缓冲液洗脱两个床体积 再用含NaCl10 0 3mol L的Tris HCl缓冲液梯度洗脱 空肠弯曲菌28KD 31KD外膜蛋白的初步提取及鉴定 发酵液离心 双蒸水洗涤 称重 每4g菌泥加入0 2mol L pH2 2甘氨酸 盐酸缓冲液120ml 4 搅拌30min 4 12000r min离心15min 取上清 透析 浓缩 SephadexG 75纯化CJ28KD 31KD外膜蛋白 SephadexG 75预处理 常规装拄 蓝色葡聚糖2000检测装拄效果 0 2mol L pH2 2甘氨酸 HCl缓冲液平衡30h 18滴 min 上样CJ外膜蛋白 上样量5ml 次 采用0 2mol L pH2 2甘氨酸 HCl缓冲液洗脱 4 条件下 收集 分管比色 浓缩 空肠弯曲杆菌 CJ 是世界范围内最常见的胃肠道炎症的致病菌之一 在发达国家CJ感染患病占腹泻病人发病率均较高 我国CJ与沙门菌的检出率占腹泻病人病原菌的34 8 57 在迄今对CJ多种亚细胞抗原的研究中 认为CJ外膜中28KD PEB1 29KD PEB2 30KD PEB3 31KD PEB4 具有相对保守性及免疫反应性 是一种共同抗原 PEB1具有较强的免疫原性并有黏附真核细胞的能力 被认为是CJ的对宿主细胞侵袭黏附素 发挥CJ在宿主肠道定居作用 SDS PAGE电泳 透析 浓缩 通过SDS PAGE知道 第1峰系67KD 92KD 108KD蛋白质 第2峰示43KD 45KD蛋白质 第3峰示28KD 31KD蛋白质 M示蛋白质Marker 1 2示CJ酸提取物的SDS PAGE条带 3 4示提取的CJ的67KD 97KD 108KD外膜蛋白 5 6 7示提取的CJ的28KD 31KD外膜蛋白 纯化细菌膜蛋白常根据分离蛋白质的分子量 形状 电荷 等电点 电荷分布 疏水性 溶解度 密度 配体结合能力 非寻常性质等理化性质不同 从而设计纯化方案 理想