高磷论文高磷对乳鼠心肌细胞的生物学效应及聚磷菌的除.doc

高磷论文：高磷对乳鼠心肌细胞的生物学效应及聚磷菌的除磷作用【中文摘要】磷是构成生物体并参与新陈代谢不可或缺的常量元素。磷广泛分布于自然界,完全可以满足人体生理所需,一般不存在缺磷现象。但过量的磷可引起人体内钙磷比例失调,导致骨质疏松、高磷血症等。过量的磷饮食还可增加慢性肾病患者患心血管疾病的危险性,也可能增加正常人患心血管疾病的危险。在慢性肾脏疾病(Chronic kidney disease, CKD)患者中,高血磷引起的心血管钙化是导致CKD患者死亡的主要病因。对于肾功能不全的肾病患者,严格控制饮食中磷的摄取量是关键,这不仅可以延缓肾功能衰竭,还可以预防肾脏病变的发生。从这些方面可以看出高磷对人和动物的健康有着重要的影响。然而不幸的是,由于环境污染和污水排放,江河湖海磷污染的现象日益严重,高磷污染的水源不仅产生了棘手的环境问题,而且严重威胁人类的健康。因而深入了解高磷对一些细胞的生物学效应,探寻能有效处理高磷的微生物,有着重要的意义。本论文通过观察不同浓度的高磷对乳鼠心肌细胞原代培养的影响,探讨了高磷对乳鼠心肌细胞的生物学效应,包括高磷对乳鼠心肌细胞增殖抑制凋亡情况和高磷对乳鼠心肌细胞钙化情况的研究,以了解高磷与乳鼠心肌细胞异位钙化的关系,从而分析高磷对人和动物健康的影响。此外,从环境样品中分离筛选了聚磷菌,并对其去除污水中高磷的效能进行分析,这对降低控制高磷引起的水体污染及饮用水安全有着重要的意义。主要结果如下：1.分别采用酶消化法和组织贴壁法分离乳鼠心肌细胞,并根据所得细胞的活力和纯度,对两种方法进行了比较,从而确定适用的分离乳鼠心肌细胞原代培养的方法。结果表明,两种方法均可得到乳鼠心肌细胞,有节律性搏动,免疫组化染色胞浆呈褐色,细胞核呈蓝色,确定为乳鼠心肌细胞。两种方法得到的心肌细胞活力均在95%以上,无显著差异(P0.05)。但酶消化得到的细胞纯度较高,为97.638%,而组织贴块法为82.295%,酶消化法优于组织贴壁法,二者有显著差异(P0.05),从第4d起,所有高磷组细胞增殖抑制率均高于对照组(P0.05)。钙沉积影响结果表明,与对照组相比,三个高磷组钙沉积量均明显高于对照组(P0.05),且钙沉积含量与作用时间及浓度有密切关系。OPN含量及表达量含量结果显示,与对照组相比,三个高磷组OPN含量及表达量显著升高(P0.05). The purity of cell from enzymatic digestion reached to 97.638%, higher than 82.295% from explant culture (P0.05). According to the effect of separation conditions on the activity of cardialmyocytes, the enzymatic digestion conditions were optimized as follow:trypsin concentration,0.125%; pH 6.8-7.0; digestion time, 40 min. The purity of the cardialmyocytes reached 95% above after adherent culture for 120 min. 2. Effect of three high phosphorus concentrations (3,6, and 9 mmol/L) on the cardialmyocytes was compared according to the calcium deposition, OPN content and expression, and apoptosis of cell. The results showed that in comparison with the control, the deposit of calcium in three high phosphorus groups were significantly higher (P0.05), and the content of calcium deposition depended to the culture time and phosphorus concentration; the expression of OPN in three high phosphorus groups was significantly increased with the increase of culture time and phosphorus concentration(P0.05).3. High phosphate led to the pro-apoptotic of cardialmyocytes. Caspase3 of the cardialmyocytes in high phosphorus groups increased after 2 d. Caspase3 content in the control group was 0.034 pmol/L while 0.344 pmol/L in the 9 mmol/L phosphorus group. After the cells cultured for 6 d, the apoptosis fragments of cardialmyocytes appeared in the groups with 6 mmol/L and 9 mmol/L of phosphate.4. A polyphosphate accumulating bacterium was isolated from wastewater and sludge samples. On the basis of physiological and biochemical poperties and 16S rDNA analysis, the isolate was identified to Arthrobacter sp. The phosphorus-removing conditions were tested in synthetic wastewater with initial phosphorus concentration of 20 mg/L. The results showed that when the temperature was 32, pH 7, inoculum size 10%, seed age 16 h, and a certain trace elements, total phosphorus in synthetic wastewater from 20 mg/L decreased to 0.1 mg/L after 10 h, phosphorus removing rate rechead to 99.5%.【关键词】高磷 乳鼠心肌细胞 骨桥蛋白 钙沉积 凋亡 聚磷菌 除磷作用【英文关键词】hyperphosphate rat cardialmyocyte cardiovascular calcification osteopontin apoptosis polyphosphate accumulating bacterium phosphorus removing【目录】高磷对乳鼠心肌细胞的生物学效应及聚磷菌的除磷作用摘要3-5ABSTRACT5-6第一章 前言12-251.1 磷的代谢131.2 高磷摄入对人和动物的潜在危害13-161.2.1 高磷摄入对骨质的影响141.2.2 高磷摄入对心血管疾病的影响14-151.2.3 高磷摄入对慢性肾病的影响15-161.2.4 高磷摄入对甲状旁腺的影响161.3 高磷对细胞的影响16-191.3.1 高磷对成骨细胞和软骨细胞的影响16-171.3.2 高磷对血管平滑肌细胞的影响17-191.3.3 高磷对内皮细胞的影响191.4 高磷对环境水体的影响19-201.5 去除磷污染的方法20-221.5.1 物理化学除磷法20-211.5.2 生物除磷法21-221.6 聚磷菌的研究动态22-241.6.1 聚磷菌的种类22-231.6.2 聚磷菌除菌能力的比较23-241.7 展望与研究设想24-25第二章 乳鼠心肌细胞的分离和原代培养25-392.1 引言252.2 实验材料25-282.2.1 实验动物252.2.2 仪器设备25-262.2.3 主要试剂及耗材26-272.2.4 主要试剂的配制27-282.3 方法28-312.3.1 乳鼠心肌细胞的原代培养28-292.3.2 乳鼠心肌细胞形态学观察292.3.3 乳鼠心肌细胞鉴定29-302.3.4 乳鼠心肌细胞活力测定302.3.5 乳鼠心肌细胞纯度测定302.3.6 酶消化条件及培养基pH对分离培养乳鼠心肌细胞活力的影响30-312.3.7 贴壁时间对酶消化法分离培养乳鼠心肌细胞纯度的影响312.3.8 统计学处理数据312.4 结果与讨论31-382.4.1 不同分离方法下乳鼠心肌细胞形态31-332.4.2 乳鼠心肌细胞鉴定33-342.4.3 乳鼠心肌细胞活力34-352.4.4 乳鼠心肌细胞纯度测定352.4.5 酶消化条件对分离的乳鼠心肌细胞活力的影响35-372.4.6 不同贴壁时间对酶消化法分离培养细胞纯度影响37-382.5 小结38-39第三章 高磷对乳鼠心肌细胞的增殖抑制、钙化和凋亡作用39-613.1 引言39-403.2 实验材料40-453.2.1 实验动物403.2.2 仪器设备40-413.2.3 主要试剂及耗材41-423.2.4 主要试剂的配制42-453.3 方法45-523.3.1 乳鼠心肌细胞的培养453.3.2 乳鼠心肌细胞生长曲线的绘制453.3.3 MTT法测定高磷对乳鼠心肌细胞增殖抑制的影响45-463.3.4 乳鼠心肌细胞的诱导钙化463.3.5 钙沉积定量46-473.3.6 钙化定性检测(VON-Kossa染色)47-483.3.7 OPN的定量测定483.3.8 RT-PCR检测OPN mRNA的表达48-513.3.9 Caspase3的检测513.3.10 凋亡DNA Laddering检测51-523.3.11 统计学处理数据523.4 结果与讨论52-593.4.1 乳鼠心肌细胞的生长曲线523.4.2 高磷对乳鼠心肌细胞的增殖抑制影响52-533.4.3 乳鼠心肌细胞的钙沉积含量53-553.4.4 乳鼠心肌细胞的钙沉积(VON-Kossa)染色553.4.5 乳鼠心肌细胞钙化后OPN含量55-573.4.6 高磷诱导乳鼠心肌细胞钙化后的OPN表达57-583.4.7 乳鼠心肌细胞的caspase3含量58-593.4.8 DNA Ladder电泳593.5 小结59-61第四章 高效聚磷菌的筛选及其除磷作用61-734.1 前言614.2 实验材料61-644.2.1 样品来源61-624.2.2 仪器设备624.2.3 主要试剂及耗材62-634.2.4 培养基的配制63-644.3 方法64-674.3.1 聚磷菌的分离筛选64-654.3.2 聚磷菌株的生长曲线