MTT实验指导-大汇总.doc

MTT大汇总实验前应明确的问题1. 选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。2. 药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。4. 培养时间。200ul的培养液对于10的45次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。5. MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。6. 理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。7. 实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。8. 避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。实验步骤贴壁细胞：1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。2. 5%CO2，37孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度，每孔100ul，设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况.3. 5%CO2，37孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。4. 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。5. 终止培养，小心吸去孔内培养液。6. 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。7. 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）MTT的配制MTT一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性，用的时候小心，有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.配制MTT时用用PBS溶解，也有人用生理盐水配，60水浴助溶。PBS配方：NaCl 8gKcl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g调ph 7.4定容1L关于细胞的接种（铺板）细胞过了30代以后就不要用了，因为状态不好了；培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。接种时最好按照预实验摸索出的密度接种， 因为细胞密度在10000/ml左右时，所测得的OD值的区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性关系最好，结果最可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显，太密细胞可能都会凋亡，因为细胞长的太快营养会不够，最后导致死亡。且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。细胞密度要根据不同细胞的特点来定.如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度，如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度，这样与对照的区别更明显，数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到105，贴壁细胞可为103-104.其它的声音：1. 首先细胞的接种密度一定不能过大，一般每孔1000个左右就够了，我认为宁少勿多。尤其是对于肿瘤细胞。10000/孔是太高了，这样即使药物有作用，MTT方法也是表现不出的，最佳点板浓度在4000-5000/孔，太少的话SD值会很大。2. MTT本身就是比较粗的实验，增殖率10%左右的波动都不算奇怪。特别是新手，20%的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关。3. 我做的是肿瘤细胞的MTT实验，这种细胞长的很快一开始我是用100000/ML的浓度来接种的，结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关系.后来调整浓度，用过4000080000/ML的浓度都做过MTT实验，结果发现做的结果比较好点的是6000070000/ML的浓度组的.用40000/M的浓度的组，由于细胞少，药物作用的梯度还是有，只是没有很好的线性关系.还有根据细胞生长速度以及药物的特性（有时间依赖性和浓度依赖性的药物）来确定培养时间是48小时还是72小时.注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。虽然移液器比移液管精确得多，但是如果操作不熟，CV会在8%左右。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。首先说说我的一点经验：1. 吹打时悬液总量不能太多，达到吸管吸液量的3到4倍，可能比较容易混匀。10ml的离心管里面最好装34ml的悬液：悬液太少容易吹起很多气泡，悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。2. 同时每次吸管的吸液量最好在1ml左右：吸液量过多的话，一下吸起很多液体，管中所剩就很少，这样吹打容易起泡，吸液量过少，吹打的力度就不够，吹打就会不均匀。如果是吸液量1ml多的吸管，总液量在5ml左右为益3. 吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。4. 吹打次数100左右，就可以吹打均匀了（有人认为加细胞前吹打30-50次基本就差不多均匀了。加细胞的时候每接种2孔反复吹打3次，每吹打3次后枪头垂悬与细胞悬液中5秒钟，然后再以一定的速度吸取悬液。）5. 向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周边很少，这种不均匀的分散会产生接触抑制，影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢。我习惯每块板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在往返回复3下移动，目的是使得细胞能分散的均匀些。（铺板技术是MTT实验的关键，也是基础，一定要练好。曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞，最后细胞全死了，建议不要采用这种方法混匀细胞。加入MTT个人认为MTT最关键的是你的细胞数目和你加入真正起作用的的MTT的适当比例，具体细胞数目和真正起作用的的MTT之间的关系确实不好确定，我认为MTT多加一些比少加好一些。MTT的量各家报道不同，一般是过量的，所以10ul即够了。如果不使用96孔板，培养基超过100ul，MTT按照10%的比例加入.加入MTT以后振荡一下让MTT与培养基混匀，不过这个应该关系不大。如加入MTT后都有个别孔立即变为蓝黑色，则污染的可能性極大，另外MTT稀釋後加入細胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜.且在加MTT前可以先在镜下观察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是临近的因为血清中白蛋白对大部分的药物都有结合效应，所以可以单独将药物和MTT加在一起，看会不会起反应。如果不起反应，就不用去除含药物的培液，直接加MTT即可。如何清除上清百家争鸣：1. 加DMSO前要把液体吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会吸去，可在这之前先用平板离心机离心96孔板，2000r，5分钟，然后吸掉上清（如果是悬浮细胞，则推荐此法，悬浮细胞要离心2500rpm10min.且其做MTT最好用圆底型96孔板，清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉，建议各孔吸弃150-160ul即可）。2. 我每次将MTT加入后，再孵育四个小时，然后用离心机离心1000G，5min。但是用枪小心地吸上清，还是会将一小部分蓝色结晶吸出。所以还是建议翻转倒扣的方法吧！3. 另外，可以直接将板翻转倒扣（垫几层滤纸）2-3次，比用“吸”的办法更不容易使细胞脱离出来。可以轻拍，或者倾斜一点帮助吸液，发现紫色结晶几乎没有肉眼可见的掉脱，但前提是你本身细胞贴壁要比较牢，半贴壁生长的细胞容易脱离。假如药物作用时间长的话，阴性对照组可能由于细胞过多而使加入MTT后形成的结晶漂起来，这样就不能直接倒掉上清。(必须是贴壁细胞！)4. 做MTT时，这一步骤一定要小心，不要采用倒的方式。因为贴壁不牢的细胞会被倒掉，从而影响OD值。悬浮细胞，不要翻板，离心后也不要翻板，这个方法害死人。5. 加完MTT反应3-4h后，从培养箱取出96孔板的动作要轻柔，避免振荡结晶，使其滑落.你可以试着将96孔板倾斜30度角，然后用枪尖慢慢吸，有的细胞可以用排枪一起吸，有的则要耐心的一个个用枪头吸，枪尖的力度和方向要保证每个孔都一致。不要让枪头接触到孔底，且一旦倾斜孔板后就不要反复倾斜放平，这样也会使结晶脱落。6. ！用医用的注射器加上针头吸取液体的，吸取时要把板子斜放，沿着壁吸取就好了！这次MTT我用1ml针头仔细吸培养液，觉得比其它方法可靠，一般不会吸走紫色结晶.避免清除上清而改进的方法由于一般可离心96孔板的离心机不好找。既使是贴壁细胞做MTT时，用DMSO溶解得到结果也不好，不是得不到预期结果就是可重复性差。解决方法1：用以下文献方法：周建军等，评价抗癌物质活性的改良MTT方法，中国医药工业杂志，1993，24（10）：455-457具体方法：配三联溶解液：10%SDS，5%异丁醇，0.012mol/LHCL，蒸馏水溶解。三联溶解液：SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml用双蒸水溶解配成100ml溶液操作：在培养板上加一定密度的细胞悬液，90ul/孔；如需给药，则再于同时（悬浮细胞）或4h后（贴壁细胞）加入不同浓度的药物10ul/孔，均设三复孔。另外，每块板上另没一个调零孔（只加培养液，不含细胞和药物）。培养2d后，加入MTT溶液20ul/孔，继续培养4h，然后加入上述三联液100ul/孔，于37度放置过夜后，用酶标仪测各孔A570值。优点：简化操作，提高了可靠性。解决方法2：日本同仁有一种新试剂CCK-8试剂， CCK-8试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST8其化学名称为：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲 染料（Formazan dye）。生成的甲物的数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。CCK-8试剂中已预先配入了进行细胞增殖和毒性分析所需的成分，无需再用缓冲液或培养基进行稀释；同时，CCK-8试剂无需任何放射性同位素和有机溶剂。因此，无需特别的技巧，就可使每一位使用者准确、快速地得到重现性好的实验结果。解决方法3：使用MTS解决方法4：加入DMSO在同一批实验中最好不要更换DMSO。加DMSO前把孔中液体尽量弃干净，没有去掉上清直接加DMSO，一是沉淀会很难溶解.二培养液的颜色在检测时也能被测到，会对最后结果造成影响。但前提是不能把细胞也一起吸掉，因为这样带来的误差要远远大于培养液没弃干净带来的误差，所以要在保证细胞不被吸掉的前提下，尽量把培养液吸掉。如果培养液没弃干净，空白孔也要留有等量的培养液，这样在检测时可以尽量去除培养液的影响，DMSO的量也可为100ul或150ul.1. 加了DMSO后用振荡器轻轻振荡5-10min， 时间控制尽量严格一点，放置时间长了会影响结果，值会偏大，且结果不可信.2. 加入DMSO后可用排枪反复抽吸助溶，溶解后尽快检测。如果实验孔不多，建议用此法，因其比振荡溶解效果好。3. 或放入37度放孵箱15分钟溶解结晶。振荡是为了让甲臜溶解，这样才能更好的测量吸光度，振荡96孔板有专的振荡器，目的：扎破气泡.有气泡存在时，由于其对光的反射与折射作用（酶标仪的原理是通过测定特定波长透过样品的吸光度推测样品内特定物质的浓度），会导致结果偏移.OD值的测定至于测定波长的选择是因显色溶液而异的，对于DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值，而ATCC公司的MTT试剂盒用的不是DMSO，它的测定波长是570。（就如ELISA实验选用OPD作底物测定波长是492，选用TMB显色液则用450）；而对于SDS和酸化异丙醇，则选用570nm，并且建议以655nm作为参考波长。DMSO溶后10分钟内测，越放颜色越深，而SDS做为溶解液测吸收光值，其值可在三天内保持不变.细胞密度偏大测出的吸光度也会偏大，细胞密度小吸光度也会偏小；另外跟细胞状态也有关系，细胞状态不好的话，吸光度值也会低的；细胞数目少，或者是培养的时间短，OD值也会偏低。如果各个孔的孔间差异性特别明显的话说明有可能存在污染，空白孔的OD值太高，很可能是细菌污染。复孔直接的OD值差别一般应在0.1-0.15，差别太大考虑：1.接种细胞数不均匀，或是接种太多，应保证每孔一致，一般是每孔1000-10000个。可以细胞细胞计数后，加入细胞悬液，再补培养基到预定体积，并轻轻吹打几次，使细胞均匀分布，这样比直接加入预定体积的细胞悬液要好，接种时应加含血清培养基。2.贴壁时间：18-24h，如果不够，悬浮的细胞会被吸掉。一般为了实验的准确，每个浓度可以设5-6个复孔，可以最后统计时，可以除去一个最高值和一个最低值，或者除去其中数据离谱的值，这些离谱数字的出现与细胞是否污染，细胞是否在培养期间死去，是否培养液蒸发过多，加MTT液是否准确，在37，5%二氧化碳培养箱中孵育时间是否一定（1-4小时）等有密切的关系，当然测定OD值的仪器工作状态是否正常也非常重要！（一般开机预热20min）。MTT方法的吸收度在0.20.8之间误差较小。这和分析化学中的lambert-beer定律有关， 对朗伯-比尔定律的偏离在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线的情况，特别是当吸光物质浓度较高时，明显地看到通过原点向浓度轴弯曲的现象（吸光度轴弯曲）。这种情况称为偏离朗伯-比尔定律。若在曲线弯曲部分进行定量，将会引起较大的误差。在吸光光度分析中，仪器测量不准确也是误差的主要来源。任何光度计都有一定的测量误差。这些误差可能来源于光源不稳定，实验条件偶然变动，读数不准确等。在光度计中，透射比的标尺刻度均匀。吸光度标尺刻度不均匀。对于同一仪器，读数的波动对透射比为一定值；而对吸光度读数波动则不再为定值。吸光度越大，读数波动所引起的吸光度误差也越大透射比很小或很大时，浓度测量误差都较大，即光度测量最好选吸光度读数在刻度尺的中间而不落两端。待测溶液的透射比T在15%65%之间，或使吸光度A在0.20.8之间，才能保证测量的相对误差较小。当A=0.434（或透射比T=36.8%）时，测量的相对误差最小。其它的声音：1. 最好用570nm波长的滤光片，因为MTT在这个波长的吸光度是峰值，换句话说灵敏度高。用其它波长的也有，一般是490nm，但我的经验灵敏度降低一半。2. 我们用的BIO-TEK公司的ELx800，一般值在2以下都是可靠的，如果复孔之间值相差太大就要考虑是否是实验过程中的误差. 我曾经看到园子的有些帖子报道说OD值大概在0.2-1.2范围内与活细胞数有较好的线性关系，但OD值在0.3-0.9范围内可能更佳，若你的OD值不在这个范围内则你实验的细胞数可能不太合适，应调整你的细胞数。边缘效应96孔板四周一圈的孔一般只做空白，不养细胞，否则这四行的数据会偏高或偏低，96孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具有一定的温度，由于温度梯度使得边缘的孔水分蒸发较快，导致培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同。对于这种现象，要保证培养箱中的湿度，减少开关培养箱的次数和时间。解决方法：将孔板周围的一圈孔全部不用，影响非常大，而且最外一圈一定要加水、PBS或者培养液，只要能防止蒸发就可以.关于如何计算IC50（1）改良寇式法：lgIC50=Xm-I（P-（3-Pm-Pn）/4）Xm：lg 最大剂量I：lg（最大剂量/相临剂量）P：阳性反应率之和Pm：最大阳性反应率Pn：最小阳性反应率举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式：Pm=0.95Pn=0.06P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1lgI=lg0.1/0.01=1lgIC50=-1-1*（3.1-（3-0.95-0.06）/4）=-3.6025IC50=0.00025（2）Bliss法：自己查阅书籍（3）IC50计算软件，见下面附件（4）自己用EXCEL做趋势线来求IC50，关于LD50的方法与此相似！（5）在线求IC50或EC50：http:/chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm结果统计学处理所有数值以xs表示，应用SPSS软件进行方差分析，p0.05时为相差显著，p0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50。或计算抑制率。细胞死亡率%=OD对照组-OD实验组/OD对照组excel表中可以做两两比较的T-test，这个你可以参考一下；你的数据应该用多个样本均数的T-test，方差分析也可。用的软件是SPSS或者SAS。孔板的重复利用：培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。一般贴壁生长的细胞用重复利用的培养板效果不是很好，因为培养板表层在生产时涂有一层促进细胞贴壁的物质，在清洗后多半会失去。悬浮或是半悬浮生长的细胞还可以。建议不要用太多次，即使是进口的板子使用次数也不要超过3次，底值最好在测得值的1/3一下。强烈建议培养板不要重复使用：1、泡酸是可以，但是泡完酸的板子很不利于细胞的生长，会出现帖壁不好，细胞生长缓慢等情况.2、这样的板子消毒灭菌很不彻底，如果有万一，则因小失大.3、重复用的板子洗不干净在培养过程中易出现杂质.重复利用时做法1：洗净后用2%NaoH浸泡4小时，再用1%稀盐酸浸泡4小时，冲洗15遍，蒸馏水冲洗3遍，烘干，UV照射过夜（紫外2小时以上消毒即可）做法2：泡酸2-4小时，老师让我们别超过4小时，（普通的玻璃仪器是过夜）。捞出，冲洗干净，烘干后，UV 照射过夜。估计跟其他收集在一起，钴60照射消毒。做法3：1. 做完MTT后用大水流尽量将板冲净，然后用洗衣粉水泡几个小时（小心最好让洗衣粉先化开）。2. 用自来水冲净洗衣粉水，倒扣晾干。3. 重铬酸钾加浓硫酸配成的酸液中浸泡过夜泡洗液（六小时以上即可）后自来水洗净（20次左右）每个孔都要处理。4.用去离子水冲洗3遍，双蒸水冲洗3遍，烤干。5.超净台中紫外线照射2个小时左右，就可以用了，不可以高压。做法4：1、测完值的96孔板甩掉孔内培养液，放入超声中超10-30分钟，晾干（或烘干）备用。此步骤可最大程度的洗去污垢及细胞。2、每孔加入50-100ul的胰酶（0.05%），我一般加60ul，加完胰酶后水平振荡96孔板以使胰酶均匀覆盖于细胞表面，室温下放置至细胞被消化脱落为止。假如你想消化快一点的话可将96孔板放到37度培养箱内（胰酶在37度时的活力最大）。对于顽固贴附在壁上的细胞，此步骤最为有效。3、甩掉胰酶，自来水下冲洗，晾干（或烘干）备用。如果不烘干就泡酸，那么96孔板残留的水分将稀释酸液，长期以往泡酸的效果下降。4、将晾干的96孔板泡酸（中强酸）过夜，捞起后自来水下冲洗10遍；双蒸水冲洗3遍。三蒸水冲洗3遍。烘干备用。泡酸时特别注意时间不要太长了，否则板子变黄，影响最后的OD值的测定。5、做实验前，96孔板至少在紫外灯下照射30分钟，但不能长期照射。紫外线长期照射可使板变黄，我的两块板放在超静台上忘了拿出来，一直照了两个星期，等我从超静台上取出板已经变成黄色。注：1、在实验中若你测得某一个孔的数值偏高，虽然有很多因素会导致数值偏高，但是如果是板底的污点引起的话你可以消除。拿出96孔板擦一擦值偏大孔的板底部，再测值。你会发现孔高的值又会到正常水平。因为咱们做实验时手不可避免的接触96孔板板底留下痕迹，这些痕迹就会使吸光度升高。2、96孔板洗的次数多了，板底自然留下划痕，这就会导致读数的不均而影响实验结果。你不妨在做实验前测一次96孔板的值（此值为初值），实验测得的为后值。后值减去初值就接近实验的真实值。MTT实验心得MTT实验是检测细胞活力的实验方法，由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此也常常用来检测细胞的增殖情况。MTT的原理：活细胞有琥珀酸脱氢酶，将MTT还原成棕褐色沉淀。由于一般介绍园子里已经很多，笔者将自己的心得按照实验流程与大家交流交流。1、培养好细胞点板。养细胞没啥好说的，如果不知道细胞如何养，那就看看相关的文献方法。如果知道了细胞的名字，就可以上检索细胞的培养信息，这个网站上的培养方法是标准培养方法。当然可以根据自己实验要求进行修改。由于细胞计数很繁琐，点板时的细胞浓度是最难掌握的，这一点笔者的心得如下：自己先将细胞养一段时间，大概了解细胞的增殖情况，在MTT检测时实际上要求细胞大概能长满96-孔板的80-90%，如果打算养48小时就检测，根据细胞的生长情况反推点板时的细胞浓度状况。这时可以将细胞不进行计数，将消化好的细胞混匀后（可能是10 ml）直接在一个废弃（最好进行过无菌处理）的96孔板中依次加入180、100、50微升细胞，将细胞放置几分钟就会沉到板底了，这时在显微镜下观察，推测哪个孔的细胞48 h能基本长满板底，假设50 微升的孔比较合适，而点板时每孔需点200 微升，那么就将细胞浓度再稀释4倍就可以正式点板了，这时顺便将细胞进行计数（因为实验记录要求写啊）。这样就OK了！如果细胞还太多，将细胞稀释4倍后再重复以上操作。注意：不要过分信赖细胞计数，因为细胞计数的取样量为20 微升左右，由于颗粒的分布不均匀，代表性是很差的。建议：细胞计数一定要会，但不要完全依赖它。点板时一定要将细胞消化成单个细胞，而且一定要混匀，最好用排枪，否则，MTT的SD会狂大。2、点板布局。其实这一点很多人不懈一顾。如果你的细胞要养48 h或更长，建议不要吝啬96-孔板的四周边孔，这32个边孔不能使用，建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分。因为细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及里面的药物会出现浓缩现象，细胞的状况就复杂了，有些人称之为“边缘效应”这些孔的SD也会狂大，既然如此，不如不用。3、加MTT。如果确认你考察的药物没有氧化还原性，你可以直接加入MTT溶液（总体积的1/10），如果你没有把握，建议在加MTT前换一次液；如果你肯定考察的药物的氧化还原性很强，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建议你用PBS将细胞洗洗，否则这些药物会将MTT还原成棕褐色沉淀，这种效果可能是你不需要的。4、加入MTT后的反应。时间为3-4h，此时弃去各孔中的液体在加入200微升的DMSO。为了将沉淀溶解完全，尽可能将水弃除干净，加入DMSO后在摇床上震摇10min。提醒：如果你的细胞贴壁不好，此时的沉淀在弃去液体时易丢失，因此贴壁不好的细胞在点板时记得将96孔板用多聚赖氨酸处理处理，要么在弃液体时先用甩板机离心，再轻轻弃去液体。关于DMSO的量，每孔的体积有点儿差异不干扰检测，只要能将沉淀完全溶解就行了。至于DMSO的体积差异不同为什么不影响检测值已经被数学证明了，在此我不多说，如果有人不明白我再证明给他看。当然为了养成良好的实验习惯，DMSO的体积还是一致的好。5、检测MTT。还原的MTT在460-630均有较好的吸收，如果你的酶标仪是滤光片，可以选470 nm左右或630 nm左右的滤光片，如果酶标仪有单波长，你可以在检测前扫描一下吸收谱，选用最大细说波长检测就是了，最大波长，大概在550nm附近，必要时加一个参比波长以扣除非特异性吸收。6、吸收值分析。在理想的MTT实验中，如果是细胞抑制实验，不加药物处理组的吸收值应该在0.8-1.2左右，太小检测误差占的比例较多，太大吸收值可能已经超出线性范围。这个原理在朗伯-比尔定律中有解释。7、如果你觉得MTT中出现的问题不好解决，那么建议你做CCK-8实验，原理与MTT相似，但操作上简化些，当然，费用也稍微高一些。 请问在做MTT实验室是否遇到过下面的情况：调零孔我用的培养基，在加MTT孵育4小时后，溶液颜色没有发生太大变化，为黄色，吸取溶液加入DMSO之后，溶液为粉红色，并不是无色，而且在490nm下的吸收值为0.2左右，我感觉挺大的，而加药组的最高浓度还不如调零孔的大，如果把调零孔的值减掉之后，OD值为负值。另外加药组加MTT4小时之后，溶液颜色有些发红。对照组测出的OD值在0.40.5之间。接种体积为100ul，5000cells/well，第一天接种，第二天加药，第三天测mtt，波长490nm。我做了很多次，每次的调零孔都那样，我想不是污染，而且也没污染的迹象。我怀疑时培养基的问题，而且我做过两次测试，一组只加含血清的培养基，一组为不加血清的培养基，其它孔接种细胞，细胞浓度分别为10000cells/well，5000cells/well，2500cells/well，这两次的结果：三个浓度下的OD值两次的都比较吻合，但加含血清培养基的和只加培养基的孔的OD值还是很高，应当还在0.2左右。不知是什么原因，请分析。另外，你所给出的值是不是在570nm下测的，我感觉在490nm下不会那么高吧，而且你复孔之间的差值一般是多少？ 不好意思，你说的现象我没出现过。还得注意几点：1、MTT应该新鲜配制，在4度保存最多不能超过2周，也有说10天的，反正不能太久。2、如果你养细胞的时间长，中途不换液，96孔板周边的孔是不能用的，应该加入无菌PBS。3、如果有心，你可以在700 nm做一个参比吸收，将每个孔的检测吸收减掉参比吸收后再分析。4、加入DMSO之前应尽可能将培养液弃除干净。问：96孔板里的细胞长的好象没有在培养瓶里的好,有的时候都无法判断板里细胞的死活了.不知道有没有什么办法? 丁香网友chinaefulle认为：1、对于贴壁细胞：死细胞呈圆形，贴壁差；活细胞呈伸展状，贴壁好。2、对于悬浮细胞似乎不好直接判断。有一个经典方法，就是用台盼蓝染色，细胞染上色的就是死细胞，然不上的就是活细胞，染色很快，一分钟内就可以判断，原因是活细胞的细胞膜完整，而且有什么外排机制，不易着色。如果96-孔板养不好，可以试着用24孔板。如果是旧板养不好，就试着用新板。为了将旧板洗干净，旧板可以下硫酸洗液2-3 h，但不要太长，否则板就黄了。还有一点，旧板的细胞培养时贴壁较差，可以铺多聚赖氨酸试试。如果你的细胞不好养，尽量不要用旧板。问：加MTT孵育4小时后，溶液颜色没有发生太大变化，为黄色。我想请问一下，你的MTT是用无血清培养基配的吗？因为我有一次就是加错了，用正常的含血清培养基配了，结果颜色就不对了，干扰了MTT的检测。丁香网友chinaefulle认为：MTT为淡黄色，用0.1 M的PBS配制，浓度为5mg/ml，配好后直接取20 ul加入到完全培养的细胞孔中（总体积在200 ul左右，MTT的体积占总体积10%）就行了。不要用培养基配制，更不要加血清，因为MTT的稳定性不太好，溶液越复杂，就可能导致MTT越不稳定。问：我也做了很长时间的MTT实验，一直用的是570nm，和您说的波长所测值会有很大差异吗？ 丁香网友chinaefulle认为：如果酶标仪用的是滤光片，那就没啥选择性。570nm的吸收也是挺高的。波长不同吸光度会有差异，但不影响检测结果的趋势变化。如果你用的酶标仪有单波长（三棱镜或光栅衍射产生的），那么选用最大吸收波长有利于减少非特异性吸收所导致的误差。 问：我在的实验室做MTT实验所用的波长是双波，630和470 ，实验室的酶标仪没有570，不知单波和双波有何区别？ 丁香网友chinaefulle认为：单波长也是可以用的。双波长主要可以扣除非特异性吸收，比如细胞颗粒造成的吸收和板孔背景导致的非均一性吸收。如果使用96孔板前先检测板孔的背景吸收在0.05以下，或高于0.05的孔标记最好不用，单波长也能大体扣除因此造成的非特异吸收。对于细胞造成的非特异吸收，细胞数越多，这方面的吸收也越高，对结果判断的方向性不会有太大影响。下图A是氧化型MTT的吸收曲线，B图是还原型的MTT吸收曲线，对于你的酶标仪建议使用470 nm问：MTT用PBS配制,原先培养基中10%FBS会影响结果吗?丁香网友chinaefulle认为：不会，因为上清会弃去，每一个孔中都平行有10%FBS，即使有影响，其影响的大小也是可以通过阴性对照扣除掉。 问：我一直在想一个问题，为什么网上见的protocol绝大部分都是MTT加1020ul，然后放34h再测？是为了节省试剂？我想在某种程度上时间能更重要些，但为什么不增加MTT的量，减少孵育时间呢？从我的实验来看，增加MTT、降低孵育时间是可行的。但是现在也存在一个问题，就是即使用到5000/well，现在不加药的孔的OD也能到1.5甚至2以上。是否有MTT增加的原因？这个还在进行验证。希望有我这种实验经历和想法同行一起讨论。 丁香网友chinaefulle认为：你提的这个问题很好，值得探索。但是目前都是约定加入10%体积的MTT，然后反应3-4h。我个人猜想可能与以下原因有关（纯属猜测，因为没做过实验）：1、根据我的经验，MTT的溶解度不是太好，所以0.5%的MTT母液（相当于10X）已经可能接近最大溶解极限，而直接用含血清的培养液配制因为带入的成分复杂，MTT保存的稳定性可能存在疑问。所以使用孵育3-4h的条件。2、MTT是琥珀酸脱氢酶的人工底物，底物浓度过高可能导致酶抑制，当然，MTT是否有此作用值得实验验证，但大多数酶的底物浓度过高时会产生酶的抑制作用（直接的抑制作用）。问：我的MTT是用PBS配的，5mg/ml，因为每孔的溶液量为100ul，所以我加了10ul。现在我的调零孔孵育4小时后为黄色，但是加入DMSO之后，还是红色的，490nm下的吸收值为0.2左右。难道是我买的培养基或是血清有问题，我用的是GIBCO