toll样受体及其研究进展.docx

Toll样受体、信号通路及其免疫的研究Toll样受体最早是在研究果蝇胚胎发育过程中发现的，它不仅是果蝇胚胎发育过程中的必需蛋白，而且在免疫应答过程中具有重要作用1。Toll 样受体(TLRs)是一个模式识别受体家族，它们在进化上高度保守，从线虫到哺乳动物都存在TLRs，它能识别病原微生物进化中保守分子，如脂多糖(LPs)、肽聚糖、酵母多糖以及病原微生物的核酸等等脂多糖受体TLR4是发现的第一个TLRs，至今在动物中已经发现15种TLRs(在人体已经发现11个成员，即TLRlTLRl0和TLRl4，小鼠不表达TLR10，但发现了TLR11132，在鸡中发现了TLR153。哺乳动物的TLRs同果蝇的TLRs一样，同属于I型跨膜蛋白，主要由3个功能区构成：胞外区、跨膜区和胞内区。胞外区具有富含亮氨酸的重复序列，能够特异识别病原微生物进化中保守的抗原分子病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)4。 为了有效地抵抗入侵的病原体，机体需要对多种PAMPs产生适当的免疫应答，TLRs可以通过识别PAMPs诱发抵抗病原体的免疫反应。而且TLRs也参与识别有害的内源性物质1. Toll样受体1.1 Toll样受体的发现 Toll是在昆虫中发现的一个受体蛋白，参与昆虫胚胎发育时背腹肌极性的建立。进一步研究发现，Toll胞内区与哺乳动物中自介素-1受体(IL-1R)的胞内区具有很高的同源性，下游的信号转导通路通过NFkB样因子发挥作用。IL-1R是免疫相关分子，而且昆虫中抗微生物的多肽基因上游大多有NFkB样因子结合位点，是否Toll蛋白也参与昆虫的天然免疫反应调控?研究证实Toll参与昆虫的抗真菌免疫真菌感染时果蝇Toll通路被激活，诱导大量的抗真菌肽Drosomycin，Toll的突变导致果蝇极易受到真菌的感染1。哺乳动物存在Toll的同源分子，即TLRs。TLRs是一个受体家族。1.2 TLRs分子特征 TLRs为一类型跨膜蛋白，其细胞外区域存在由1831个氨基酸组成的富含亮氨酸的重复单位（LRR motif)XLXXLXLXXL(X代表任何氨基酸，L为亮氨酸)每个LRR由2429个氨基酸组成，为8折叠一环一a螺旋的结构。整个LRR结构域形成一个马蹄型的结构，参与识别各种病原体。它们的细胞外区域较长，在550980氨基酸之间，而且同源性较差，如TLR2与TLR4细胞外区域的同源性只有24%。提示TLRs各个分子之间所结合的配体具有不同的结构、性质；但各个分子种属间的差异较小，如人和小鼠的TLR4胞外区有53相同，而胞质区则高达83，提示着它们是一组非常保守的分子，执行着相似的功能。TLRs的胞内区含有Toll/IL-1受体同源(Toll/IL-1 receptor homologous region, TIR), 其中包括3个保守盒(conserved boxes)，参与信号转导。TIR是一个保守结构，其中的23个氨基酸的位置是固定的，所形成的三个结构域分别为这些分子的标志区域和信号介导区域。具有TIR结构域5分子现在发现的共有31种，如MyD88、IL-1相关蛋白激酶(IRAK)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)等。1.3 TLRs的配体（PAMP）及其特异性 TLRs配体按来源可分为外源性和内源性配体。外源性配体主要来自病原微生物，是微生物进化过程中的保守成分，如细菌的脂多糖、胞壁酸、肽聚糖以及细菌和病毒的核酸等。内源性配体来自宿主细胞，如热休克蛋白、细胞外基质降解成分等等，内源性配体在机体应激或是组织损伤时释放6，7。TLR4识别 G-菌的LPS；TLR2可识别G+菌、分枝杆菌及真菌的PAMP。TLR9识别细菌特殊序列胞嘧啶磷酸鸟（CpG-DNA）；TLR5 识别细菌鞭毛蛋白。 目前对TLR生物学作用研究的焦点集中在介导对LPS的反应，而LPS的生物活性成分是脂质A。3种天然对大剂量LPS耐受的小鼠C3H/HeJ、C57BL/10ScCr、C57BL/10ScN，它们的突变基因均位于TLR4基因位点。TLR4基因敲除鼠对LPS耐受，而TLR2基因敲除鼠可正常应答，TLR2等位基因缺失的中国仓鼠卵细胞对LPS反应正常，从遗传学上支持TLR4是LPS的主要受体。但体外试验观察到用埃希大肠杆菌的LPS刺激鼠巨噬细胞株RAW246.7，TLR2mRNA的表达增加，但用脂质A刺激C3H/HeJ鼠脾巨噬细胞，TLR2mRNA表达显著减少，表明TLR2对脂质A的反应呈依赖性7。对此可能的解释有，TLR2对LPS的作用需与TLR4形成异二聚体，在TLR4激活之后可能作为“第二受体”被启动表达，辅助免疫应答。Tapping等8用纯化后的埃希杆菌和沙门菌的LPS刺激人单核细胞株或全血，TLR4抗体明显抑制了TNF-、IL-8释放，而TLR2抗体无明显抑制作用。因此纯化的LPS只激活TLR4，而TLR2可能是对LPS以外的成分反应。故目前认为TLR2和TLR4都参与了对LPS的反应，但TLR4是G-菌LPS的主要受体，TLR2不起主导作用9。2. TLRs的信号通路TLRs的信号特点与炎症和免疫有关。TLRs识别配体后，可传递给细胞内的接头分子一MyD88、Mal、TRIF和TRAM。这些分子可以通过激活炎症的主要调节物NF-kB、MAPKs和IFN-，引起多种细胞因子的释放，上调抗原提呈细胞(antigen-presentingcells，APCs)表面CD80(B71)、CD86(B7-2)等共刺激分子，并最终激活特异性免疫系统，保护细胞。根据TLRs的信号传递是否包含MyD88，TLRs信号传导通路又可分为MyD88依赖性和非MyD88依赖性两种信号传导途径10。其中TLRl、TLR2、TLR6、TLR7和TLR9介导的信号传导途径为MyD88依赖性，TLR3介导的信号传导途径为非MyD88依赖性，TLR4则既可为非MyD88依赖性和非MyD88依赖性11。 2.1 MyD88依赖型途径 MyD88依赖性信号传导途径是除TLR3外所有TLR以及IL-1受体家族传递信号的共同传导通路12。MyD88是一种胞质衔接蛋白。细胞中大部分MyD88是以一种非活性形式存在于细胞骨架中，即与肌动蛋白结合形成一种复合物。此时，MyD88与IRAKl处于分离状态。在静息状态细胞中，IRAKl与MyD88调节蛋白-Toll相关蛋白(Tollinteracting protein，Tollip)结合，保持一定稳定性。经过配体刺激，肌动蛋白重排，MyD88释放至细胞质中，并聚集至TLR/IL-R处；同时，IRAK4发挥激酶的作用，使IRAK1磷酸化，降低MyD88与Tollip的亲和力，Tollip从二聚体上脱落下来，从而完成信号向下游的传递13。具体信号转导的过程为通过接受配体刺激，TLR发生二聚化；TLR胞质中的TIR结构域与MyD88的羧基末端相互作用，MyD88用其DD区募集IRAK4并且促进IRAK4介导的IRAK1的磷酸化；激活后的IRAKl将发生进一步的磷酸化，高磷酸化的IRAKl与MyD88解离，进入胞质募集可溶性TNF受体相关因子6(TRAF6)，导致2个不同信号途径的激活。一种途径是通过激活MAPKs(如p38和JNK)，从而活化转录因子激活蛋白-1(AP-1)。另一途径是激活TAKlTAB复合物，增强IKK(IKB激酶)复合物的活性，进一步诱导IKB的磷酸化及后续的降解，最终导致NFKB激活。研究发现，常染色体隐性MyD88基因缺陷的儿童反复遭受化脓性细菌感染(包括侵袭性肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌)。提示MyD88依赖途径在化脓性细菌感染的过程中具有免疫保护作用14。目前认为，感染性疾病、淋巴瘤、痛风、肥胖、类风湿性关节炎、SLE及老年痴呆症等疾病的发生、发展与MyD88介导密切相关15-17。2.2非MyD88依赖型途径 最初研究表明某些特定的LPS诱导TLRs的活化途径不需要MyD88的参与18，研究发现，在MyD88缺失的情况下，某些TLR活化所需的激动剂(如LPS)同样可以激活信号传递。MyD88非依赖途径主要与树突细胞的成熟、IFN-的诱导及干扰素调节基因的表达有关，由TLR4和TLR3介导激活。不同的TLR信号传导途径引起的特定的免疫应答取决于TIR区域与何种胞内衔接蛋白结合19。这些结合蛋白主要是一些具有TlR结构的、MyD88的同源蛋白。近来发现的介导下游信号的衔接蛋白有4种:TIRAP (TIRdomain contain ing adaptor -pmtein)，TRIF(T1R domainconIaining adaptor inducing IFNB)，TRAM (TRIF, relate- ddaptor molecule)和SARM(sterilealpha and armadillo motif containing protein)20。TIRAP，也称为Mal(MyD88adaptorlike)，作用于TLR2和TLR4的下游分子21；TRIF主要作用于TLR3和TLR4的下游分子22,23，通过激活调节干扰基因转录的关键分子干扰素调节因子(intemmnregulatingfac-tor3，IRF3)诱导IFNA/B基因的表达；TRAM主要参与TLR4的信号转导。3. TLRs在宿主防御反应中的作用TLRs在机体抵抗细菌、病毒的感染中起着重要的作用。一些TLRs能够识别细菌的胞壁成份、鞭毛蛋白，产生一系列炎性因子介导抗菌免疫应答；一些TLRs能够识别某些病毒的包膜糖蛋白，介导早期的抗病毒作用；还有一些TLRs能够识别病毒产生的特定RNA以及细菌、病毒未甲基化的cpG核苷酸序列(CpGDNA)，诱导机体产生IFNd和炎症细胞因子，介导抗病毒应答。研究显示，与野生型小鼠相比TLR9基因敲除小鼠对布鲁氏菌更易感染24。TLRs识别 PAMP后，通过TIR区域向胞浆内传导信号，激活 等转录因子和蛋白激酶，释放IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-、一氧化氮（NO ）合成酶等，表达 B7分子（CD86、CD80），在天然免疫、炎症反应和获得性免疫中发挥作用。IL-1、IL-6、IL-10等是具有代表性的介导天然免疫的细胞因子，可激活和驱使自然杀伤细胞、单核细胞和吞噬细胞进入炎症局部，清除病原体。结核杆菌19000MW脂蛋白以TLR2依赖的方式激活巨噬细胞一氧化氮合成酶（iNOS）启动子，生成NO发挥直接杀菌作用25。TLRs诱生的细胞因子可进一步激活免疫细胞或细胞因子受体，释放多种细胞因子、趋化因子、粘附分子、血管活性物质等，扩大免疫炎症反应。许多病原体感染均可通过TLRs的激活而引起炎症反应。痤疮丙酸杆菌经人单核细胞表面 诱导产生IL-12、IL-8，在痤疮病灶局部的巨噬细胞表面也有TLR2的表达，表明痤疮丙酸杆菌通过激活TLR而造成痤疮的炎症反应26。 疟原虫感染引起的肝损伤，是由于经 通路产生的IL-12对肝淋巴细胞产生细胞毒性作用，而且肝损伤的程度与血清IL-12的浓度呈正相关27。TLRs也是获得性免疫的重要参与者。TLRs诱导抗原呈递细胞表达共刺激分子B7（CD86、CD80），向初始T细胞提供活化的第二信号，使活化的T细胞对抗原产生特异性应答。抗原呈递细胞经TLRs诱导产生细胞因子IL-12可促进CD+4T细胞向Th1分化，并增强NK细胞和CD+8T细胞的杀伤能力。分枝杆菌的脂蛋白就是以TLR2依赖的方式激活巨噬细胞生成IL-12p40，诱导Th0向Th1分化。并且TLR在DC的成熟过程中扮演重要的角色。未成熟的DC（immature，iDC）不能激活初始T细胞，iDC在外周摄取抗原后被激活，进入周围淋巴结，分化为成熟 DC（mature，mDC），其抗原捕获能力下降。Visintin等28研究了当人单核细胞转化为iDC和mDC时 的表达情况，实验表明单核细胞表达大多数TLR，而在iDC形成过程中大多数TLR表达水平明显下降，只有TLR3、MD-2在iDC明显增加。LPS刺激iDC后，用抗TLR检测到iDC表面有微量的TLR1和TLR4表达，由于TLR4是LPS的主要受体，故推测LPS经4TLR诱导DC成熟。而mDC只表达TLR1、TLR6，这与mDC失去对LPS反应的结论相一致。除LPS外，CpG-DNA可通过TLR9促进APCs成熟29。初始免疫中不同的 被激活是否诱导不同的TLR获得性免疫类型，目前尚不清楚。有实验观察到埃希大肠杆菌LPS诱导鼠巨噬细胞TLR4依赖的Th1型反应，而porphorymonos gingivalis LPS则诱导了非TLR4依赖的TH12型反应30。用TLR2、TLR4的激动剂分别刺激DC，TLR4激活后产生IL-12p70和IFN-诱导蛋白（IP）-10，这两种细胞因子都与Th1型反应有关，而TLR2激活后产生IL-12抑制性p40同二聚体（IL-12 inhibitory p40 homodimer），倾向于Th2型反应的发生31。Krieg等32回顾了细菌CPG-DNA对系统性红斑狼疮的致病性，认为感染是自身免疫疾病的诱因之一。细菌CPG-DNA诱导了人和鼠B细胞多克隆增殖；IL-6释放；及自身反应性细胞的凋亡抵抗。分泌类风湿因子的B细胞激活需要B细胞受体和TLR-MyD88的协同参与33。这些与感染密切相关的自身免疫性疾病，是否存在TLRs的功能失调引起炎性因子，共刺激因子的表达紊乱，影响DC的功能，引起T细胞活化过度，产生针对自身抗原的T细胞，打破免