生物制药细胞工程单克隆抗体ppt课件

EmilvonBehring 1901 antitoxins GeoregesKohlerandCesarMilstein 1984 monoclonalantibody SusumuTonegama 1987 structureofIggene GeraldEdelmanandRodneyPorter 1972 structureofantibody PaulEhrlich 1908 productionofantibody NobelPrizewinners 发明单克隆抗体技术NobelPrizein1984 抗体发展的三个阶段 单克隆抗体 基因工程抗体 多克隆抗血清 传统抗血清 抗原 免疫 所有抗体混合 1 2 3 4 脾脏 淋巴結 B細胞 细胞工程杂交瘤技术 鼠单抗 人单抗 大鼠 小鼠 产量高 操作比小鼠麻烦少用 易操作 多用 HAMA反应 人人杂交瘤 人B细胞 骨髓瘤细胞融合 人鼠杂交瘤 人B细胞 鼠骨髓瘤细胞融合 杂交瘤制备人单抗的问题 染色体易丢失 抗体分泌不稳定 美国已上市16种单克隆抗体药物2002年销售额29亿美元2005年90亿美元我国的单克隆抗体药物市场还处于起步阶段 2002年完全人源化单抗humira获得批准上市 这是单克隆抗体药物发展具有里程碑意义大事 预示着单克隆抗体药物一个迅猛发展的新时代的来临 Humira是Abbott CAT公司开发的一种治疗类风湿关节炎的单克隆抗体药物 Avastin是美国刚刚上市的治疗结肠癌的抗体药物 也是第一个从抗体库中筛选出的Fab段抗体药物 Avastin的上市使公司的股价上升了90亿美元 抗血小板凝集的原理图 抗体药物销售趋势图 全球有超过200家上市或未上市公司正在研发用于临床诊断和治疗的单克隆抗体正在进行临床试验的抗体公司 38家 AbgenixAlexionPharmAltarexAppliedMolecularEvolutionBASFBiogenBioTransplantCAT CambridgeAbTech CelltechCenteonCentocor Johnson Johnson ElanElsaiEliLillyGenzymeTransgenicsGenentechGenmabHoffman LaRocheICOSPharmIDECPharm MitsubishiImCloneSysImmunotechKaneboKnollPharm LeukoSiteMedarexMedimmuneNorvartisOrthoBiotechPasteur MerieuxProgenicsProteinDesignLabScheringSmithKlineBeechamTanoxBiosystemsTechnicloneXomaZenyaku MonoclonalAntibodiesontheMarket MonoclonalAntibodiesontheMarket 抗体是对其抗原有极强专一性的魔弹或巡弋飞弹 研究以免疫转印法检测特定抗原医疗以毒素连结抗体攻击病变細胞检验以ELISA侦测特定病原体 SDA批准进入临床的体内诊断用抗体 131I 抗人肝癌单克隆抗体 HAb18 Hepama 1 99mTc 抗人小细胞肺癌单克隆抗体 2F7 SDA批准进入临床的治疗用单抗 抗T细胞免疫毒素抗C ALL免疫毒素131I 抗肝癌单克隆抗体抗人CD25单克隆抗体抗乙脑单克隆抗体抗流行性出血热抗体抗人CD3单克隆抗体抗人IL 8单克隆抗体 抗体治疗疾病的机制 抗原失活免疫效应细胞吞噬抗原表面弱化易受补体破坏 单抗研发的演变历程 鼠单抗100 鼠源OKT 3PanorexZevalin 鼠 人嵌合单抗 66 75 人源 ReoPro RituxanRemicadeSimulect 人源化单抗 90 95 人源 Zenapax Mylotarg Herceptin CampathSynagis 100 人源 抗体攻击病毒 凝集细菌 抗SARS的单抗 SARS CoV 抗体生成技术 Epitope Antigenicdeterminant 抗原決定基 一个抗原分子上可能有数个抗原決定基 每個抗原決定基至少誘生一種專一性抗体 蛋白质性抗原決定基含有六个以上氨基酸 整体水平抗体生成技术 细胞工程抗体生成技术 基因工程抗体生成技术 多克隆抗体 抗血清 单克隆抗体 嵌合抗体 改形抗体 小型化抗体 单链抗体 组合抗体库技术 噬菌体抗体库技术 Ig基因转基因小鼠 抗体真核表达技术 1多克隆抗血清 对健康人用疫苗进行主动免疫 免疫前 a 和免疫后10天 b 分别采血并对血清蛋白进行凝胶电泳分析 免疫前血清中的g球蛋白条带较宽 免疫之后则相对集中 Bruton氏病患者血清蛋白中的 球蛋白条带缺失 c a1 a2 b g 白蛋白 球蛋白 c a b 来源 组织和细胞 其成分比较复杂 1 组织和细胞成分混合抗原制备2 蛋白质抗原制备3 核酸抗原制备4 类脂多糖抗原制备5 免疫球蛋白片段制备6 纯化抗原的鉴定 二 可溶性抗原制备及鉴定 可溶性抗原 蛋白质 糖蛋白 脂蛋白 酶类 补体 脂多糖 细菌外毒素和核酸 可溶性抗原制备及鉴定 返回 组织和细胞成分混合抗原制备程序 上清液澄清 所用材料必须是新鲜或低温保存的 去除包膜或结缔组织 脏器进行灌洗 洗去血迹及污物 NS内含0 5g LNaN2 冷浴中组织剪碎 装入捣碎机简内高速粉碎制成组织匀浆液 3000r min 10min 取上清液 去除细胞碎片及微小组织 离心 绵羊红细胞的制备流程图 摇动15 20min 4 可保存3周 取适量 NS洗涤3次2000r min10min NS稀释至2 5 细菌细胞抗原的制备流程图 液体培养或斜面培养37 24h 100 水浴2 2 5h杀菌 无菌试验 NS稀释成8 10亿 ml O菌体抗原 返回 杂交瘤技术过程 多克隆抗体 多克隆抗体 polyclonalantibody 指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物 如 免疫血清 含多种特异性抗体 实际意义 1 预防 治疗感染性疾病 如 破伤风抗毒素血清 抗破伤风 胎盘球蛋白 抗病毒感染等副作用 超敏反应 2 临床诊断 如 肥达氏反应 伤寒 副伤寒缺点 特异性差 多价抗原 单克隆 致敏的B细胞 单克隆抗体 单克隆抗体 传统抗血清的交叉反应 专一性反应 沒有反應 交叉反应 123AgA xyzAgB 1 20AgA 可生产有用抗体的淋巴細胞若与癌细胞融合 则形成稳定而可培养的细胞株 癌细胞可培养生长 浆细胞Bcell可分泌抗体 融合瘤Hybridoma 细胞融合 两组染色体混在一起 也可以培养生長产生专一性抗体 一個Bcell只产生一种抗体 一个B细胞只能生产一种抗体 对付某一抗原決定基 若有许多抗原決定基 则需许多株B細胞分別生产许多抗体 B B B Y Y Y Y 抗原 B Y B 亲和力成熟 1 1 2 3 4 抗原決定基 1 2 3 4 1 2 3 4 单抗 细胞融合 取出脾細胞 癌細胞 各抗体分开 1 2 3 4 m 核酸补救合成 m 核酸从头合成 核酸 氨甲喋呤 A 次黄嘌呤 H 胸苷 T TK HGPRT TK HGPRT 抗体 a b c d a b c d BALB c a b b c d 传统抗体 抗血清 是所有抗体的混和 脾脏产生各种B細胞 免疫前要先把抗原作成乳剂 免疫 抗原 采血后可得传统抗血清 已建立之小鼠骨髓癌细胞株 由脾脏收集B細胞 抗原通常有多个抗原決定基 免疫后的脾脏 约在两月內注射五到八次 AgX 细胞融合 AgX AgX ELISA HAT PEGCellfusion Hybridomacells融合瘤细胞 Subcloning 确定只有一种细胞 d d abcd abcd X d c b a d 分株培养筛选 筛选 单抗 传统抗体 抗血清 试验专一性 对抗原的反应 无法分辨 完全不同 抗体的结构 1小分子抗体 3鼠单抗人源化 基因工程改造的抗体 2 1 小分子抗体 1 2 3 小分子抗体 Fab 抗原结合片断Fv 可变区片段ScFv 单链可变区片段SdAb 单区抗体 免疫球蛋白基因载体的构建 H链表达载体 L链表达载体 共转染细胞 PrVHCH1PrVLCL 图5Fab抗体分子的制备 IFabantibodymolecule 抗体分泌细胞 VH VL CL S S CH1 图5Fab抗体分子的制备 IIFvantibodymolecule 双特异性抗体 抗原A 抗原B S S Fab VH CH1 VL S S CH1 VH VL Fv VH VL 许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点 使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接 将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起 可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别 取得杀伤肿瘤细胞的作用 CTL CD3 TUMORCELL S S VH CH1 VL S S CH1 抗原A 抗原B 2 抗体融合蛋白 抗原结合部位与生物活性蛋白结合 含Fc段的抗体融合蛋白 免疫黏附素Fc的作用 检测 纯化 延长血清中半寿期生物学效应功能 G CSF Fc FusionProtein DNAligation expression Fc的作用 延长血清中半寿期 3 鼠单抗人源化 将小鼠Ig基因敲除 转染人Ig基因 在小鼠体内产生人Ab 再经杂交瘤技术 产生大量完全人源化抗体 恒定区人源化 人 鼠嵌合抗体 可变区人源化 人改型抗体 用抗体库技术进行人源化 鼠单抗人源化 Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL 免疫球蛋白基因载体的构建 H链嵌合载体 L链嵌合载体 共转染细胞 启动子 人 鼠嵌合抗体基因工程改造策略 鼠VH 鼠VL 人CL 人CH 抗体分泌细胞 人 鼠嵌合基因工程抗体 定义 指利用基因工程技术 将人抗体可变区 V 中互补决定簇 CDR 序列改换成鼠源单抗CDR序列 重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体 RAb亦叫 重构型抗体 因其主要涉及CDR的 移植 又可称为 CDR移植抗体意义 多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗 人改型抗体 CDR移植 人源化抗体又称CDR移植抗体 CDR序列 CDR序列 鼠单克隆抗体 人抗体 人源化抗体 图4鼠单克隆V区人源化 CDR移植 抗体库技术 抗体库 在原核系统功能性表达多样性抗体基因 repertoire 三基因工程方法研制新的单抗 抗体库技术产生的三项技术基础 RT PCR 能够克隆全套抗体可变区基因 抗体基因片段在大肠杆菌的功能性表达 噬菌体展示技术 phagedisplay 接头DNA VHVL 图2噬菌体表面呈现的小分子抗体 基因III或基因VIII 外壳蛋白 VH VL 噬菌体抗体图示 定义 将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体 转染工程细菌进行表达 然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体 利用这一技术可以得到完全人源性的抗体 在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性 噬菌体抗体库技术 用PCR扩增人抗体重链可变区 VH 和轻链可变区 VL 基因克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增 使抗体基因以分泌的方式表达 获得可溶性的抗体片段 抗体库 组合抗体文库 在建库过程中如果将VH和VL随机组合人天然抗体库 抗体mRNA来源于未经免疫的正常人 一 基本原理和程序 噬菌体抗体库 从外周血或脾 淋巴结等组织中分离B淋巴细胞 提取mRNA并逆转录为cDNA 应用抗体轻链和重链引物 根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的Ig基因片段 构建噬菌体载体 噬菌体抗体库载体有 噬菌体 丝状噬菌体和噬菌粒三种 其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体抗体库 surfacedisplayantibodylibrary 常用载体 表达载体转化细菌 构建全套抗体库 通过多轮的抗原亲合吸附 洗脱 扩增 最终筛选出抗原特异的抗体克隆 构建噬菌体抗体库 模拟天然全套抗体库抗体文库可以达到或超过1011库容 能包含B细胞全部克隆建库的外源基因来自人体多克隆细胞的总mRNA通用引物具有人的种属普遍性抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性避开了人工免疫和杂交瘤技术抗体库的大容量抗体库极高的筛选效率可获得高亲和力的人源化抗体VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程所用的抗体基因又来自人体 二 噬菌体抗体库技术的特点 抗体库的构建 抗体库的富集筛选 治疗性抗体的研发阶段 靶标发现抗体制备抗体筛选 确认和优化中试工艺研究临床前研究临床研究 主要研究进展 靶抗原的发现抗体人源化改造及人源抗体制备提高抗体效应功能提高抗体表达量其他 靶抗原的发现 TRAIL TNF relatedapoptosis inducedligandTRAILR DR4 DR5 DcR1 DcR2 OPG Proteinextractionanddigestion Treated Sick Control Healthy MassSpectrometer Proteinpeptides identification MSspectra quantification characterization P O Phosphorylation Oxidation posttranslationalmodifications PTM Peptides andMS MSspectra HPLC Proteomics 20a5 6HeavyChain 功能单抗识别表位可能是一个新的药靶 主要研究进展 靶抗原的发现抗体人源化改造及人源抗体制备提高抗体效应功能提高抗体表达量其他 治疗性抗体产生抗 抗体的比例 抗体人源化的主要技术 嵌合抗体CDR移植 FR移植 SDR移植表面氨基酸残基人源化抗原表位定向选择 嵌合抗体 CDR移植抗体 SDR人源化方法 鼠抗体 红 和人源化抗体 绿 Fv结构的叠合图 表面氨基酸残基人源化 人源化抗体识别的抗原表位与親本抗体相同 抗原表位定向选择 H L 人抗体重链文库 人源抗体制备技术 人 人杂交瘤技术EB病毒转化技术人源抗体库噬菌体抗体库合成抗体库核糖体展示抗体库转基因动物 人源抗体的生产过程 大容量抗体库 合成抗体库 核糖体展示scFv文库 各种抗体库筛选方法 感染性筛选 抗原库对抗体库筛选方法 提高抗体特异性和亲和力 Chainshuffling 计算机模建技术 定点突变技术 chainshuffling原理示意图 L H L L L L H L H L H H H H H L 更高亲和力抗体 亲和筛选 建抗体库 亲和筛选 重链文库 建抗体库 轻链文库 高亲和力抗体 亲本抗体 抗体H22计算机分子设计与直接进化 S B 10 11M Ka 6x1010L mol B F 抗体CH22m亲和常数测定 Items Z12Ka 8 107M 11 750CH22Ka 9 109M 11 6 5mCH22Ka 6 1010M 11Remicade Ka 1 1010M 11 6 Antibodyaffinity 移植人免疫球蛋白的小鼠 抗体结构信息具有重要的研究价值 Her2靶点人源抗体 HF 的设计与验证 HF人源抗体对Her2 细胞的ADCC杀伤效应分析 新抗体或抗体类似物的设计 以抗原 抗体复合物的晶体结构设计新抗体以人抗体Fc为支架设计类抗体以全人抗体为支架设计小抗体以非Ig的人蛋白为支架设计功能分子 PT4 Linker FC融合蛋白的构象 PT4 Linker FC与TNF 相互作用复合物的构象 拮抗肽 linker Fc融合蛋白设计 单域抗体 PTVH5 设计 PTVH5与TNF形成的复合物模型 单域抗体单链抗体 scFv 单链抗体 TSA1 TSA2 设计 主要研究进展 靶抗原的发现抗体人源化改造及人源抗体制备提高抗体效应功能提高抗体表达量其他 抗体药物的作用机理 直接效应诱导凋亡抑制增殖阻断生长因子或生长因子受体干扰血管生成间接效应依赖补体的细胞毒 CDC 依赖抗体的细胞毒 ADCC 作为毒素 放射性同位素和细胞毒药物的载体形成抗独特型抗体通过双特异性抗体靶向效应细胞 抗体偶联细胞毒物质 TUMORCELL Fab 免疫毒素 植物和细菌 同位素 I131 I125 In111 抗体导向化学疗法 甲氨喋呤 长春新碱 阿霉素 裂解药物的酶 抗体偶联细胞毒物质 S S 链亲和素 免疫毒素 白喉毒素蓖麻毒素相思豆毒素 C C V C V C C C SPDP SPDP RicinA RicinA Fc RI RicinA 抗体融合蛋白 抗体融合蛋白 抗人Her2 neu单抗 IL 2 CTLA 4 Ig 抗纤维蛋白 ProUK 抗活化血小板 UK 双功能抗体作用原理 BsAb BsAb 效应细胞 靶细胞 触发受体 膜表面分子 NK细胞 CD16 肿瘤细胞 HER2 neu 抗HER2 neu 抗CD16BsAb BsAb 双特异性抗体介导的杀伤作用机制 a BsAb桥连效应细胞和靶细胞 b 连接的触发分子启动细胞毒反应 c 效应细胞对靶细胞产生致死性杀伤反应 细胞毒反应 细胞内抗体 在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体 细胞核 EGFR EGFR EGFR 目前细胞内抗体的研究主要集中在单链抗体上 在ScFv的C端或N端插入其它靶向信号 targetingsignals 如分泌信号 核定位信号 线粒体定位信号和内质网滞留信号等 从而进行检测 识别 发挥特定功能 细胞内抗体 细胞内抗体的作用机理 阻断靶蛋白的活性部位阻断细胞内蛋白 蛋白相互作用干扰细胞内靶蛋白的转运促使靶蛋白降解 细胞内抗体的应用 由于细胞内抗体具有高亲和力及选择结合特性 因而可通过多种机制调控细胞的生理过程及代谢 主要为 分子功能的研究下调生长因子受体的表达抑制细胞内癌蛋白的活性抑制病毒复制 如抗HIV外壳蛋白gp120抑制艾滋病毒复制 细胞内抗体广泛应用前存在的问题 基因转移系统的建立 特别是体内基因转移时基因的靶向传递的问题 使细胞内抗体基因导入充足数量的靶细胞中 细胞内抗体基因的持久表达及使细胞内抗体达到一定的浓度 细胞内抗体应无毒及不具免疫原性 鼠源性ScFv可引起人体发生细胞毒性T 细胞反应 应用人源性或人源化抗体可克服此问题 抗体的ADCC和CDC效应 提高ADCC和CDC的策略 抗体Fc突变改变抗体糖基化 RituximabFc的三维结构 Rituximab突变体与C1q的结合 主要研究进展 靶抗原的发现抗体人源化改造及人源抗体制备提高抗体效应功能提高抗体表达量其他 提高表达量的方法 应用扩增系统GS DHFR弱化选择标记基因应用有利于基因表达的元件强启动子强增强子反式作用元件位置效应 positioneffects Cre LoxP定点整合系统 抗体的糖基化 主要研究进展 靶抗原的发现抗体人源化改造及人源抗体制备提高抗体效应功能提高抗体表达量其他 抗体可变区和框架区的影响抗体稳定性可溶性折叠动力学表达 PEG化的抗体或抗体片段 重组多克隆抗体 重组多克隆抗体 优点 可大量生产 批间稳定性好结合抗原的亲合力高识别多个抗原表位 对复杂靶抗原的治疗效果好对于易变的抗原也能有效 二 单克隆抗体的应用 1 医学检验试剂 传染病的快速诊断 寻找TSA及检测TAA 免疫细胞抗原检测 激素测定 血中药物浓度监测 HLA分型监测 二 单克隆抗体的应用 2 导向治疗作用3 抗原物质的分离和提纯 抗体靶向的酶前药治疗ADEPTantibodydirectedenzymerodrugtherapy 抗体与