DNA的半不连续复制教学内容.ppt

DNA的半不连续复制 尹泽群药实1201 半不连续复制模型的提出与完善 1968年冈崎提出DNA不连续复制模型 认为新合成的3 5 走向的DNA链实际上是有许多5 3 方向合成的DNA片断连接起来的 1978年Olivera提出半不连续 semidiscontinuous 复制模型 也就是说前导链上的合成是连续的 只有后滞链上的合成才是半连续的 现在已经弄清原来是由于细胞内都存在有dTTP和dUTP 而DNApol 却并不能区分它们 因此也会将dUTP加入到DNA中 形成A U对 那么在DNA中为什么没有U的存在呢 这是因为E coli细胞里有双重 保险 防止了U的 混入 第一道关是细胞里的dUTPase 它能使dUTP变成dUMP dUMP是不能作为DNA合成的底物 这样它就不再能加入DNA中 但总还有些漏网之 鱼 它们还是逃过此关 混入DNA中 这就靠第二道关来清除 异己 这道关的主角是尿嘧啶N 糖苷酶 uracilN glycosylase 它可以切断混合尿苷的糖苷键 形成无Pu和Py位点 apurinicorapyrimidinic AP 再由AP内切酶在AP位点切出一个缺口 进一步进行切除修复 在细胞内尿嘧啶N 糖苷酶作用较快 而AP酶作用较慢 在新链合成之初约1200bp就有可能掺进一个U 但很快就被尿嘧啶N 糖苷酶切断糖苷键 在AP酶未作用前在脉冲标记实验中就提取了 用NaOH沉淀时 AP位点十分易断裂 所以前导链也成了小片段 问题的提出 DNA两条链反向平行 一条链走向为5 3 另一条链为3 5 但所有DNA聚合酶合成方向都是在引物3 OH上合成 使链从5 3 延长 那么5 3 链是如何同时作为模板复制呢 假设的提出 新合成的3 5 走向的DNA链实际上是有许多5 3 方向合成的DNA片断连接起来的 脉冲标记实验 pulse labelingexperiment 检测结果 1 被3H标记的片段 也就是新合成的片段 沉淀系数为20S左右 即都是长1000 2000Nt的DNA片段 而亲本链要比它大20 50倍2 先合成的 带标记 的DNA不再是短片段 而和总DNA的情况相似 沉淀系数为70S 120S较长的片段 这意味着刚开始合成的片段都是短片段 以后再连接成长片段 得出结论 DNA复制时 以3 5 走向为模板的一条链合成方向为5 3 与复制叉方向一致 称为前导链 另一条以5 3 走向为模板链的合成链走向与复制叉移动的方向相反 称为滞后链 其合成是不连续的 先形成许多不连续的片断 冈崎片断 最后连成一条完整的DNA链 冈崎片段 相对比较短的DNA链 大约1000核苷酸残基 是在DNA的滞后链的不连续合成期间生成的片段 这是ReijiOkazaki在DNA合成实验中添加放射性的脱氧核苷酸前体观察到的 复制叉 DNA合成由RNA引物引发 冈崎片断合成也需要引物 RNA引物的消除和缺口填补是由DNA聚合酶 完成的 最后由DNA连接酶连接 DNA复制的复杂性保证了复制的高度忠实性 E coli复制时 每个碱基对错配频率为10 9 10 10 是高保真系统 新DNA链合成时需引物 引物后又要切除 再以DNA链取代 DNA聚合酶在合成时还有校对功能 每引入一个核苷酸都要复查一次 未核实则不能继续进行聚合反应 在复制过程中还有许多辅助蛋白 E coli就至少有15种 复制叉的复杂结构进一步提高复制准确性 DN