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第六章目的基因筛选与DNA文库的构建 目的基因的获得 基因文库 genelibrary 从物种的基因组或cDNA中PCR扩增 人工合成基因 准备要分离 改造 扩增或表达的基因 基因文库 Genelibrary 由大量的含有基因组DNA 即某一生物的全部DNA序列 的不同DNA片段的克隆所构成的群体 称之为基因文库 一个完全的基因文库 应该能够保证从中筛选到目的基因 即Genomiclibrary 基因组DNA文库 指将某生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段 与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落 按照外源DNA的片段 基因组DNA文库和cDNA文库 包含基因的全部信息 如编码区 非编码区 内含子和外显子 启动子及调控序列 cDNA文库 complementaryDNA互补DNA由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经反转录形成的cDNA 它们所构成的重组DNA克隆群体 则称之为cDNA基因文库 反映了基因表达普 对研究基因表达 调控及基因互作非常有用 基因组DNA文库的构建程序 1 载体的制备 2 高纯度大分子量基因组DNA HighmolecularweightDNA HMWDNA 的提取 3 HMWDNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离 PFGEsizeselection 4 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞 5 重组克隆的挑取和保存 构建噬菌体文库 连接产物不用电转化的方法转化宿主 而是采用包装蛋白进行包装并侵染宿主 文库的代表性和随机性 代表性文库中所有克隆所携带的DNA片段重新组合起来可以覆盖整个基因组 即可以从该文库中分离任何一段DNA 采用酶切或随机切割的方法来消化染色体DNA 以保证克隆的随机性 保证每段DNA在文库中出现的频率均等 增加文库总容量 外源片段大小和重组克隆数量 1976年L Clark J Carbon提出了一个完全的基因文库所需克隆的计算公式n ln 1 p ln 1 f n 一个完全基因文库所应包含的重组体克隆数p 所期望的目的基因在基因文库中出现的几率f 插入片段的平均大小与基因组DNA大小的比值 哺乳动物3 109kb若p 99 平均克隆片段20kbf 20kb 3 109n 690773 2 E coli4 639 221bpp 99 f 20kb 4600kbn 1056 9 p 99 f 10kb 4600kbn 2116 一 用于构建基因文库的载体 第一节基因组DNA文库的构建 可装载的外源DNAPlasmid 10kb Phage0 23kbCosmid 45kbBAC 100kbYAC 300kb 1 2Mb 粘粒克隆所需的克隆子数是 phage的一半 如 需700000时 cosmid需350000个 噬菌体改建的 利用了噬菌体的包装效率高和杂交筛选背景低的优点 经改造的质粒载体或人工染色体 其主要优点在于可容纳超过100kb以上的外源片段 YAC可用于克隆500kb以上 甚至几Mb的DNA片段BAC可减少DNA分子间的重组 置换型载体 cos cos R L Centralstuffer 1 phagevectors 目前用EMBL系列 2019 DASH Charon38 40 GEM 11等置换型载体 插入片段的最大值可达20 24kb 有利于分子杂交进行筛选 43kb 左臂 右臂和填充片段的大小分别为20kb 9kb和14kb 克隆DNA片段的大小为9 23kb 2 Cosmidvector 柯斯质粒 由噬菌体的cos序列 质粒的复制序列及抗生素抗性基因 所有cosmidvector均可用于构建文库 cos序列 噬菌体DNA的包装序列 T4噬菌体DNA连接酶 多连体分子 二 用 phage构建文库1 总DNA的提取DNA初始长度应至少是用于克隆的片段的4倍 否则有效片段较少 因此DNA至少应大于100kb cosmid 200kb 2 载体臂的制备 购买 载体制备 纯化 限制酶消化BamHI EMBLXhoI GEM 11 载体臂的纯化 梯度离心 蔗糖或NaCl 梯度离心的收获量大 而agarose回收量小回收无填充片段聚乙二醇沉淀 除去碎片 置换型载体 cos cos R L Centralstuffer 3 基因组DNA的消化一般采用Sau3AI消化回收20 24kb agarose法or梯度离心 有些载体可做不完全补平 4 连接 包装连接形成较长的多联体 包装成 粘粒 4 6个月稳定 5 扩增和保存重组phage可在E coli中扩增 所得文库可被长时间利用和贮存 可用于多个不同基因的筛选6 在宿主菌上形成噬菌斑7 带有目的外源DNA序列的 phage重组体的鉴定8 对选出的重组phage进行噬斑纯化 再对外源DNA进行分析 载体的去磷酸化 提高连接和包装效率 双酶切消化载体 EMBL系列 2019 XDASH Charson40 35 34 EMBL3A SalIBamHIEcoRI E1B1 S1 连接反应中 应测定外源片段与载体的比例 phage108pfu gDNA 若用BamHI和EcoRI双酶切 可用异丙醇沉淀或其它柱层析法去除小片段 使非重组体的数目降低2个数量级 结合其它方法如Spi筛选可再降低2 3个数量级 基因组DNA片段3 凹端的不完全补平 GATC CTAG GATC CTAG Sau3AI GAGATC CTAGAG Klenow dATP dGTP CTCGAG GAGCTC XhoI Klenow dCTP dTTP CTCTCGAG GAGCTCTC 互补 GEM 11 基因组DNA Vector 三 重组体的筛选和分析噬斑原位杂交 将噬菌体以一定密度铺于平板 并影印到固相膜上 要从哺乳动物DNA文库里筛选出目标基因 哺乳动物基因组复杂度为3 109bp 必须筛选几十万个噬斑 不同大小的培养皿所能容纳的噬斑数目 杂交筛选用探针 纯化 分析 Southern杂交 酶切Sequencing 其它方法 如免疫学方法 四 亚基因组文库的构建用基因组DNA的特定部分所构建的基因文库质粒DNA 线粒体DNA 特定限制性片段 在有杂交探针的情况下 可通过Southern杂交 先找出目标基因所在的限制性片段的大小 然后用相应大小的限制性DNA片段构建出基因文库 这样可减少筛选的压力 例如将基因组DNA用多种限制性内切酶切割 通过Southern杂交 则将SpeI切割的基因组DNA中的 8 3kb片段回收 用于构建DNA文库 发现目标基因在8 3kbSpeI片段上 哺乳动物3 109kb若p 99 平均20kbn 690773 2 E coli4639221bpp 99 平均10kbn 2134 若用占总DNA1 10区域的限制性片段 则n 69075 若用占总DNA1 10区域的限制性片段 10kb 则n 199 一 cDNA克隆用的mRNA 第二节cDNA文库的构建 1 mRNA的完整性 指导合成高分子量蛋白质的能力无细胞翻译体系 源于网织红细胞 哺乳动物总mRNA可编码 10 100kDa蛋白指导合成目的多肽的能力利用免疫沉淀和SDS PAGEmRNA的大小500bp 8kb大部分1 5 2kb 总mRNA制剂指导合成cDNA第一链长分子的能力合成的cDNA也应为上述范围脱氧胸苷酸12 18聚体 oligo dT 12 18 引物可刺激cDNA第一链的放射性活度掺入量至少增加30倍 2 mRNA的丰度高丰度mRNA珠蛋白 免疫球蛋白 卵清蛋白在特定细胞中占50 90 低丰度mRNA 0 5 被称为低丰度或稀有mRNA 文库应足够大 鉴定和分离困难 3 mRNA的富集按大小对mRNA进行分级分离分离不同大小的mRNA 先变性 如氢氧化甲基汞 后梯度离心 蔗糖 体外翻译 检测每份中的比活 cDNA的分离级分离近年来多采用此方法 特别是大mRNA 可避免降解mRNA agarose分离大小易辩 多聚核糖体的免疫学纯化法用抗体来纯化合成的目的多肽的多聚核糖体 免疫亲和柱 A蛋白 Sepharose柱 单克隆抗体把正在合成新生链的多聚核糖体结合到A蛋白 spharose柱上 随后用EDTA解离下来 通过oligo dT 层析分离mRNA 此法分离的mRNA只占总mRNA的0 01 0 05 并非都可用 根据材料 来源 特异性来选择 反转录酶AMV 42 M MuLV 37 RNaseHRNaseH弱长mRNA引物oligo dT 12 18一般要求浓度高模板氢氧化甲基汞预处理 减弱链内二级结构RNase抑制剂 AAAAAAA mRNA 5 3 TTTTTTTT 二 cDNA第一链的合成 cDNA 1 自身引导法 三 cDNA第二链的合成 2 置换合成法 有效无须进一步纯化不需用S1酶 否则会导致cDNA的大量损失 问题 如何脱帽以便进入载体5 端cDNA不能合成 少几个Nt 有可能仍形成发夹结构 3 第二链引导合成 Okayama Berg方法 4 引物 衔接头合成法 四 dscDNA的分子克隆 1 同聚物加尾 问题 只对质粒有效 文库不易保存和复制 尾的长短不一 100dA dT 20dG dC 同聚尾结合的质粒 cDNA杂合分子转化E coli的效率随宿主不同而不同 2 合成接头和衔接头 cDNA 合成接头 含酶切位点 酶切 NotI SalI 与载体连接 Optional methylation 接头中含稀有位点 如NotI SalI 100kb一次 先甲基化dscDNA 再连接接头 用衔接头替换接头 用衔接头替换接头 3 其他方法 1 mRNA cDNA杂交体克隆 mRNA cDNA AAAA AAAA RNA末端加尾效率只及DNA的1 10 合成第一链后 加尾 与带dT尾的载体退火 在宿主体内 可除去RNA 代之以DNA 优点 无须合成第二链 序列完整但效率 1 10 2 依次连加不同接头 3 RACErandomamplificationofcDNAends cDNA克隆是常出现丢失末端序列的现象 需较长时间获得全长cDNA克隆筛选文库时一般只能回收一个或几个cDNA克隆 而RACE可产生大量独立克隆 mRNA cDNA TTTTTTTT QI QO AAAAAAA A 经典RACE 3 末端克隆 TTTTTTTT QI QO 反转录 QO PCR GSP1 QI GSP2 根据已经得到的不完整的cDNA的序列设计引物GSP1 和GSP2 PCR cDNA克隆中 得到了不完整的片段 可采用此方法获得3 末端和5 末端的序列 5 末端克隆 mRNA AAAAAAA GSP1 GSP1 AAAAA Q1 Q2 TTTTTT Q1 GSP1PCR 反转录 Q2 GSP2PCR GSP2 获得的cDNA克隆片段 AAAAAAA GSP1 反转录 连接RNA寡聚物 NNNNNNNN B 新RACE 4 其他与cDNA第二链合成有关的方法 如Okayama Berg方法和引物 衔接头合成法 五 cDNA克隆用的载体 1 gt10和 gt11 gt10 可用核酸探针克隆0 6kbEcoRI插入后载体变cI cI 在hflA中发生溶原 GenBank U02447 gt11 表达载体 可用免疫探针克隆0 7 2kb可表达融合蛋白LacZ E coliC600allowinggrowthofparentalandrecombinantphageC600hflrepressesparentalphagegrowth50 100 fold recombinantphageformclearplaquesandparentalphageformturbidplaques E coliLE392allowinggrowthofparentalandrecombinantphageY1090asthehost 42 C形成噬斑 适合用免疫学探针筛选 2 ORF89kb可用于定向克隆 3 其它 gt18 19 20 21 22 23 ZAP 第三节基因克隆的策略 基因克隆的本质从文库中筛选目标克隆 重点在 筛选 常见筛选工具 探针 狭义 核酸 抗体广义 还包括其他筛选手段 抗性基因 antibiotics抗性基因 抗重金属活性 一 功能筛选 分解基因 苯环化合物 分解酶 功能活性 杀虫 酶 启动子 复制子 利用目标基因的特定功能进行筛选 Ampori MCS Tetgenewithoutpromoter Vector 将目标DAN切割成小片段 插入MCS在Tet平板上筛选抗性菌落 可得到promoter 其他标记 gfp Kan 质粒复制单位的克隆 Ampori MCS 目标宿主可用的抗性gene 将目标DAN切割成小片段 插入MCS在抗性平板上筛选抗性菌落 可得到质粒复制单位 功能缺失 在获得相应突变体的前提下以此突变体作为宿主在野生型的DNA导入后检测回复突变 如营养缺陷型相关的基因 二 核酸探针 同源DNA探针 高度保守的基因rRNA基因 邻近种属的相应基因 相应基因的序列比较 合成寡核苷酸 蛋白质N 末端aa序列 简并探针degeneracy选取简并程度低的aa序列 综合合成 可能的话设计一对 用PCR产物作探针 根据密码子的使用频率 合成猜测体探针 设计两组简并探针 用第二个探针对第一次筛选的阳性克隆子作第二次杂交 三 免疫在可获得PT后 制备抗体 用于筛选 四 高表达基因高丰度mRNA 如用苯肼作了贫血处理的兔网织红细胞中 血红蛋白mRNA的含量占绝大多数 五 1 差别杂交 五 2 扣除杂交 Tcell TCR Bcell mRNA mRNA cDNA cDNA mRNA杂交体 过量 通过羟基磷灰石柱 吸附杂交分子 Tcell TCR 特异的cDNA流出 cDNA第二链合成 生物素标记 生物素结合蛋白柱 六 mRNA差别显示 mRNA3 末端有12中可能的序列 以此12种引物引导cDNA第一链合成 引物 5 T11MN或5 T12MNM A G orC 以10核苷酸随机引物引导cDNA第二链合成 PCR 可产生50 100条100 500bpDNA条带 12种锚定引物和