rtpcr及其产物电泳分析20161101电子教案.ppt

RT PCR及其产物电泳分析 中南大学生命科学学院 实验目的 熟悉RT反应的原理 掌握RT反应的操作步骤熟悉PCR反应的原理掌握PCR反应的操作步骤以及PCR反应参数的选择与优化掌握PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测方法 实验原理 RT反应 在逆转录酶作用下 以mRNA为模板合成cDNA complementaryDNA 分子的过程 PCR反应 PCR扩增是模拟天然DNA复制过程 利用DNA聚合酶在体外扩增一对引物之间特异性DNA片段的方法 其主要热循环过程可分为三个步骤 1 变性 2 退火 3 延伸 RT PCR 以RT反应产物cDNA分子为模板进行特异性PCR扩增的过程 是检测基因表达最常用的方法 RT反应试剂 1 引物 Oligo dT 16 寡聚胸甘酸16个 要求mRNA有poly A 尾巴 mRNA1 4 2 逆转录酶 鼠白血病病毒莫洛尼株 MMLV 鸟类成髓细胞瘤病毒 AMV 3 RT反应缓冲液 常用5 浓度 4 底物 即四种dNTP的混合物溶液 常用10 浓度 2mmol L或2 5mmol L 5 模板 6 RNasin PCR反应试剂 1 引物 一对 单链的10 30nt长的DNA片段 2 TaqDNA聚合酶 3 PCR反应缓冲液 常用10 浓度 一般组成为15mmol LMgCl2 250mmol LKCl等 4 底物 即四种dNTP的混合物溶液 常用10 浓度 2mmol L或2 5mmol L 5 模板 6 RT PCR原理 微量移液器 台式微量离心机 电泳槽 凝胶成像系统 主要仪器 电泳仪 热循环仪 实验步骤 1 标记一个洁净的1 5mL反应管 向其中依次加入 RNA溶液5 LRTmix15 L20 L 2 盖紧管盖 轻轻混匀后 离心30s 使反应成份均匀富集于管底 3 42 水浴30min RTmix的成分 RNasin 5 RT反应缓冲液 2 5mMdNTPs Oligo dT 16 逆转录酶 MMLV 实验步骤 4 标记一个洁净的200 L反应管 向其中依次加入 ddH2O6 L2 PCRmix10 LPrimermix2 LcDNA模板2 L20 L 5 混合均匀后 离心30S 使反应成份均匀富集于管底 PCRmix的成分 PCR反应缓冲液 2 5mMdNTPs TaqDNA聚合酶 实验步骤 6 在PCR仪上设置反应循环参数 本次实验为 94 20s 56 20s 72 20s 循环数为26 最后于72 充分延伸5min后 终止反应 7 置反应管于PCR仪上进行热循环 8 反应完毕后 取5 LPCR产物 于1 5 琼脂糖凝胶电泳检测结果 注意事项 1 戴手套操作 避免污染 2 尽量冰上操作 3 取样准确 体系正确 4 一定要有内参 PCR平台期 PCR扩增有限性 平台期 经过一定数量的循环后 随着产物的对数累积趋于饱和 DNA分子数不再呈指数积累 而是进入线性增长期或静止期 此过程称为平台效应 PCR的离子需要 Taq酶活性对Mg2 浓度和单价离子 K 或NH4 的性质和浓度较敏感 一般PCR反应中MgCl2浓度在2 0mmol L时酶活性最高 Mg2 浓度偏高 酶活性反受抑制 变性剂的加入有助于模板变性 消除复杂二级结构 但不同变性剂及浓度对酶活性损害程度不同 PCR引物用量 一般PCR反应引物的终浓度为0 2 1 mol L 在此范围内 PCR产物量基本相同 但引物低于0 2 mol L时 则产量降低 引物浓度过高会促进引物错误引导非特异产物合成 还会增加引物二聚体的形成 结果分析 M123 M 100bp梯级DNA分子量标志物 泳道1 阳性对照 泳道2 靶DNA扩增 泳道3 阴性对照 图1PCR产物检测的琼脂糖凝胶电泳 观察结果 是否有扩增产物 如有拖尾或有几条区带 说明有非特异性扩增 分子量标准电泳后区带是否分开 与分子量标准比较 PCR产物的长度是否正确 PCR产物的产量 引物二聚体 RT PCR检测人 actin基因表达 扩增产物长度260bp 问题及解决方法 无PCR产物1 确保mRNA无降解 2 确保酶未失活 3 确保引物无降解 4 重新设置退火温度 5 重新设置变性温度 问题及解决方法 PCR产物呈拖尾现象1 提高退火温度 2 减少TaqDNA聚合酶的用量 3 试用二步法进行PCR扩增 4 调节Mg2 浓度 使之最优化 TaqDNA聚合酶发挥活性需要Mg2 参与 通过Mg2 介导与模板DNA 引物及dNTP结合 通常Mg2 浓度为0 5 2 5mM Mg2 浓度过高 将引起非特异扩增产物增多 反之 Mg2 浓度过低则导致产量降低 5 减少延伸时间 6 减少循环次数 7 设计新的引物 8 采用热启动法进行PCR 问题及解决方法 引物二聚体1 防止引物3 端互补 2 设计较长的引物 3 增大模板的量 PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高 模板DNA浓度过高会导致非特异性产物增加 4 降低引物浓度 一般为0 1 0 5 M 引物浓度过高 将错误启动延伸 即错误引发 导致非特异性产物堆积 还可形成引物二聚体 引物浓度过低则可导致扩增产量下降 5 减少循环次数 6 提高退火温度 PCR体系的优化 PCR循环参数的优化 变性95 变性20 30秒即可使双链模板DNA完全解链为单链 变性温度过高和过低均会导致DNA聚合酶活性的丧失 退火引物与模板的退火温度有引物的长度及GC含量决定 退火温度由Tm值确定 Tm 4 G C 2 A T 退火温度比Tm低3 12 延伸延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度 70 75 延伸时间由扩增片段的长度决定 500bp30s 500 1200bp40s 循环次数PCR循环次数取决于模板DNA的浓度 一般为25 35次 PCR产物可达最大值 PCR体系的优化 PCR反应成分浓度的优化TaqDNA聚合酶 1 2 5U 100 L反应液 dNTP浓度 20 200 mol L 且四种底物浓度相等 以减少错误掺入的机会 Mg2 浓度 0 5 2 5mmol L引物浓度 0 1 0 5 mol L 总之 浓度过低 P