Waters_e2695_Alliance_HPLC操作手册.doc

1.0 Review and Approval审核与批准Written By: _ Date: _起草人 日期 Approved By: _ Date: _批准人 Department Head or Designee 日期部门负责人或指定人员Approved By:_ Date: _批准人 Quality Assurance 日期质量保证部2.0 Purpose目的2.1 本标准规定了的Waters e2695型液相色谱仪的使用、维护保养和校验。3.0 Scope范围3.1 本标准适用于位于XXXXXXXQC实验室的的使用、维护保养及校验。4.0 Responsibilities职责4.1 QC人员对系统的维护以及本规程的使用负责。5.0 References/Associated Documents参考文件/相关文件5.1 Waters e2695操作员指南5.2 Waters2998操作员指南5.3 Waters2489操作员指南5.4 Empower工作站使用手册6.0 Definitions定义N/A7.0 Procedure规程7.1 设备7.1.1 四元泵，Waters e26957.1.2 控温自动进样器7.1.3 紫外可见光检测器，Waters24897.1.4 二级阵列管检测器，Waters29987.1.5 柱温箱7.1.6 溶剂脱气机7.1.7 装有Empower工作站的电脑7.2 维护7.2.1 灌装及清洗系统7.2.1.1 当真空脱气机第一次使用或当真空管是空的，或当改变溶剂，且当前溶剂与真空管中溶剂不相溶时，应当灌装清洗系统7.2.1.2 如果使用易挥发的混合溶剂或改变溶剂时，若系统长时间关机（比 如，隔夜）灌装系统推荐将泵的流速控制在高水平（3-5ml/min）。7.2.1.3 使用注射器灌装系统（干灌装）：点击仪器面板上“Menu/status”按钮，选择“Direct Function”,然后点击“dry prime”选择欲灌装的通道并逆时针方向旋开灌装/排放阀，将专用注射器插入灌装/排放阀入口内，拉动注射器活塞吸入大约10毫升灌装液或直到管路中不在有气泡为止。灌装完成后顺时针方向拧紧灌装/排放阀。7.2.1.4 首次灌装系统时，使用干灌装并使用异丙醇、甲醇、乙醇作为灌装溶剂。7.2.1.5 置换管路中的流动相，使用湿灌装：点击仪器面板“Menu/status”按钮，选择“Direct Function”,然后点击“wet prime”选择欲灌装的通道。7.2.1.6 如果当前管路中溶剂是有机的或水而当前流动相也为有机溶剂 或为水，在能互相溶解的情况下，用流动相作为灌装溶剂。7.2.1.7 如果当前管路中溶剂是有机的或水而当前流动相也为有机溶剂或为 水，但不能互相溶解的情况下，使用异丙醇灌装系统。7.2.1.8 如果管路中溶剂为有机的而当前流动相为缓冲盐或管路中为缓冲盐而流动相为有机溶剂时，使用10%异丙醇、甲醇、乙醇灌装系统。7.3 优化泵的性能7.3.1 总是把存放溶剂瓶的溶剂瓶架放在泵的顶部（或在相对于泵较高的位置）。7.3.2 当使用盐溶液的时候，常需要用水冲洗所有流路。这样就可以将阀门端口的沉淀的盐冲洗掉。在运行泵之前，用至少两倍体积（30ml）的水冲洗真空脱气机，特别是当泵关闭较长时间时或者通道中使用易挥发混合溶剂时。7.3.3 当基线长时间不能处于稳定状态时，通常情况下应考虑溶剂进口过滤器是否堵塞。当溶剂过滤器堵塞时，应将其从溶剂瓶中取出并将其放入30%硝酸溶液中超声清洗30min。在将其重新装入溶剂瓶之前，必须用MillQ水对其进行彻底的清洗。长期处于水或缓冲液中的过滤器常因为溶剂中藻类等微生物的生长，造成过滤器的堵塞。因此建议在使用完此类流动相后，用50%乙腈清洗溶剂过滤器。7.3.4 当使用缓冲溶液时，在关闭系统前必须将通道中的溶剂置换成50%乙腈，以防止藻类等微生物的生长。7.4 使用Empower色谱工作站7.4.1 双击电脑桌面上的Empower快捷图标，出现Empower登陆窗口。输入用户名与密码，点击“OK”进入Empower工作站。7.4.1.1 输入正确的用户名与密码后，点击“Advanced”，在出现的对话框中选择你需要的用户类型和操作界面。可选的用户类型和操作界面取决于你的用户权限。下面以“QuickStart Interface”界面为操作界面制定本SOP。7.4.2 在出现的对话框中的左侧选择需要的“Project”；在右侧选择需要的系统，点击“OK”。“”7.4.3 创建分析方法7.4.3.1 创建仪器方法：在出现的操作视窗中点击“Instrument”进入仪器方 法设置窗口。 7.4.3.1.1 设置输液系统参数：点击“W2690/5”图标进入输液系统设置，根据需要设置相关参数。如在“General”中设置“Stroke Volume”为“100ul（flow rate 10.000ml/min”表示泵每分钟的最大泵液量为10.000ml。需要注意的是，分析方法中需要的流速“Total Flow”必须小于设置的“Stroke Volume”，在“Need wash time”对应的下拉菜单中选择“Double”表示采用相对于仪器默认洗针体积的双倍来清洗自动进样针；在“Flow”选项下设置仪器的最高压力（通常选择默认的4000psi），最低压力，洗脱模式-等度（Isocratic）或梯度（Gradient）,流速“Total Flow”，通道以及各通道内的溶剂的比例(如100.0%A表示使用A通道，A通道的溶剂比例占总流量的100.0%)；在“Temperature”中设置柱温箱温度及自动进样器温度（如适用）；在“Solvents”选项下的各通道内备注各通道内溶剂的组成（必须和流动相标签保持一致），其他选项如无特殊规定使用默认值。7.4.3.1.2 设置检测器参数，根据7.4.2选择的系统，将出现不同的检测器图标。7.4.3.1.2.1 系统选择为“2695-2998”将出现“W2998”的图标，点击“W2998”图标出现W2998检测器的设置窗口。根据需要设置相关参数。如在窗口中的“General”选项中勾选“Lamp On”(若为关机方法则不勾选，检测器将会将氘灯关闭但不断开电源)，勾选“Enable 3D Date”（三维数据采集，如不需要可以不勾选），在波长范围中输入起始和截止波长（如210nm to 400nm表示检测器将从210nm波长开始对样品进行扫描直到400nm波长为止），选择分辨率“Resolution”（通常选择最小的1.2nm，其将会获得较为全面的扫描信息）；在“2D Channels”选项中选择信息采集通道如“Channel 1 or 2 and other”、数据模式“Date Mode”如吸光度“Absorbance”、波长、分辨率如1.2nm；在其他选项中如无特殊规定选择默认值。7.4.3.1.2.2 系统选择为“2695-2489”将出现“W2489”的图标，点击“W2489”图标出现W22489检测器的设置窗口。根据需要设置相关参数。如在窗口中的“Channel A”选项中勾选“Lamp On”(若为关机方法则不勾选，检测器将会将氘灯关闭但不断开电源)，在波长“Wavelength”中输入需要的波长，选择数据模式“Date Mode”如吸光度“Absorbance”，在采样速率“Sampling Rate”下拉菜单中选择速率，通常情况下选择2，勾选在进样开始前归零选项“Auto Zero On Inject Start”；在其他选项中如无特殊规定选择默认值。7.4.3.1.2.1 保存方法：点击“保存”在出现的对话框中输入仪器方法名称。再点击“保存方法组”，在出现的对话框中输入方法组名称。7.4.4 平衡色谱系统：7.4.4.1 在操作视窗中点击平衡系统快捷按钮“”在出现的的对话框中选择建立好的仪器分析方法，点击“Equilibrate/Monitor”开始系统平衡。7.4.5 数据采集：7.4.5.1 输入样品信息：点击“Sample Queue”，在视窗中点击“Samples”，输入进样位置“Vial”、进样量“Inj vol (ul)”、进样次数“#ofInjs”、样品名称“Sample Name”、运行时间“Run time”，选择下拉菜单中的样品分析方法“Method Set/Report Method ”，其他选项一般情况下设置为默认。7.4.5.2 保存样品信息：点击“保存样品表”，并在出现的对话框中输入样品表名称。7.4.5.3 运行样品：在确保系统基线稳定后，点击运行样品组“”快捷按钮。7.4.5.4 插入样品：在样品表运行过程中，如有需要添加的样品可以点击菜单栏中的编辑选项“Edit”，在出现的下拉菜单中选择插入正在运行的样品“Alter Running Sample”，在操作窗口中输入样品信息，输入完成后，再次保存样品表。并再次点击运行样品组“”快捷按钮。7.4.6 数据处理：7.4.6.1 选择数据：在样品运行完成后，点击浏览项目“Browse Project”，在随后出现的操作窗口中，选择通道“Channels”，在通道选项下的操作窗口内找到欲处理的数据。单击右键，选择查看“Review”。7.4.6.2 建立数据处理方法：7.4.6.2.1 三维数据：点击菜单栏中的处理“Process”在出现的下拉菜单中选择提取色谱图“Extract Chromatogram”命令，并设定处理波长。7.4.6.2.2 二维数据：直接跳过7.4.6.2.1小节。7.4.6.2.3 点击方法处理向导“”快捷图标，在出现的对话框中单选新建处理方法“Create a New Processing Method ”。7.4.6.2.1 单选新建处理方法“Create a New Processing Method ”点击“OK” 7.4.6.2.2 在计算类型“Processing Type”中选择LC（若色谱图为三维图谱则选择PDA），在积分算法“Integration Algorithm”中选择传统“Traditional”，勾选使用处理方法向导“Use Processing Method Wizard” ，点击“OK”7.4.6.2.3 输入合适的峰宽“Peak Width”，以保证可以将最小的色谱峰被积分，点击“Next”。7.4.6.2.1 输入合适的阈值“Peak Width”，以保证可以将最小的色谱峰被积分，点击“Next”。7.4.6.2.1 输入积分开始与结束时间，保证需要的色谱峰全部在积分时间段内，不需要的干扰峰尽可能的排除在外。点击“Next”7.4.6.2.2 输入最小峰面积和最小峰高，保证需要的色谱峰全部在积分时间段内，不需要的干扰峰尽可能的排除在外。点击“Next” 7.4.6.2.1 点击下一步7.4.6.2.1 选择“NO” 7.4.6.2.1 给对应保留时间的峰命名，或保持默认。点击“Next”7.4.6.2.1 点击“Next” 7.4.6.2.1 根据实际情况选择外标校准或单一内标校准或多点内标校准，点击“Next”，在出现的对话框中输入方法名称。7.4.6.1 修改样品信息：7.4.6.2 在浏览项目“Brose Project”中选择通道“Channel”，在出现的操作窗口内选定欲修改的样品。按住Ctrl，用鼠标左键可以选择多项样品，也可以按住Shift,用鼠标左键选择开始和结尾两个样品，这时开始和结尾这一段的样品将被选定。7.4.6.3 单击鼠标右键，选择更改样品“Alter Sample”，在出现的操作窗口中修改样品相关信息。7.4.6.4 首先在样品类型“Sample Type”中，将标准样规定为“Standard”，重复标准样规定为“Control”，待测样品规定为“Unknown”，然后将控制标准样和待测样品的称样量及稀释倍数分别输入“SampleWeight”和“Dilution”（若未知样品不称取重量，仅进行稀释则称样量为1。）点击保存，此时在“Altered”选项下会出现全部勾选的情况。7.4.6.5 点击含量“Amount”快捷按钮在出现的对话框中的菜单栏中点击编辑“Edit”，选择下拉菜单中的从处理方法中复制组分“Copy Component From Process Method”，在出现的对话框中选择7.4.6.2项下建立的处理方法。这时会在操作框中出现处理方法中给峰的命名。7.4.6.6 输入对应峰下的浓度，点击“OK”，并再次点击7.4.7.2小节下的图片中的保存按钮，关闭操作窗口。7.4.7 处理数据7.4.7.1 在浏览项目“Brose Project”中选择通道“Channel”，在出现的操作窗口内选定欲修改的样品。按住Ctrl，用鼠标左键可以选择多项样品，也可以按住Shift,用鼠标左键选择开始和结尾两个样品，这时开始和结尾这一段的样品将被选定（注意：应该先行选择标准溶液数据，再选择重复标准溶液及待测样品）。7.4.7.2 单击鼠标右键在出现的下拉菜单中选择计算“Process”，并在随后的对话框中勾选“Process”；单选“Use specified processing method”并在其对应的下拉菜单中选择7.4.6.2小节建立的数据处理方法；勾选“Clear Calibration”，单击“OK”。7.4.7.3 在浏览项目“Brose Project”中选择通道“Result”，在出现的操作窗口内选定刚刚处理的数据。单击鼠标右键，选择“Review”，在出现的视窗中复核处理后的结果，如无误点击“Calibration curve”，再点击“File”- “Save as”-“Process Method”，在出现的对话框中选择“Copy curves”并在随后的对话框中选择7.4.6.2小节建立的方法名称点击“Save”。7.4.7.4 当再次处理新的未知样品且需要调用共用的标准溶液时，重复7.4.7.1和7.4.7.2。注意：此时不能勾选7.4.7.2小节中提到的 “Clear Calibration”7.4.8 打印数据报告7.4.8.1 报告仪器方法7.4.8.1.1 在“方法”选项卡中选定欲打印的仪器方法，单击右键，在出现的菜单点击“打印”。注意：每次试验均必须打印仪器方法即色谱条件。7.4.8.2 报告图谱数据7.4.8.2.1 在浏览项目“Brose Project”中选择通“Result”，在出现的操作窗口内选定欲的数据。单击鼠标右键，选择“Preview”，在出现的视窗中单选“Use the following Report Method”并在其对应的下拉菜单中选择报告模板，单击“OK”。7.4.8.2.2 在出现的报告中选择编辑报告“Edit Method”。7.4.8.2.2.1 编辑表头：用鼠标指向表头中任意一Field单击鼠标右键，在出现的菜单中选“New Field”。在出现的对话框中单选左边的“Create a new Report Group”并勾选“Use Report Method/Group Wizard”；在右边方框中选择需要的添加Filed，选择好后，点击“OK”。用鼠标指向表头中任意一个Text，单击鼠标右键，在出现的菜单中选择“New Text”，并在新建立的Text文档中输入新建立的Field的简要描述。7.4.8.2.2.1 编辑数据框：双击报告中的数据框，出现如图一所示的操作框，在该操作框的左边选择需要的项目，并双击，这时在操作框的右边方框内会添加进你选择的项目。双击右边方框内的项目，出现如图二所示的操作框，在该操作框内可以按如上所述的方法添加该项目下的平均值，相对标准偏差等属性。图一图二7.4.8.3 报告中应包括但不限于仪器方法编号、数据结果编号（作为图谱的唯一编号）、数据所处项目名称、分析员、采样时期、处理日期、样品称样