流式细胞术发展和细胞组学新技术(贝克曼).ppt

流式细胞术发展和细胞组学新技术 游东生美国贝克曼库尔特公司上海 Past5years InDevelopment Source Dr PriyaKunapuli SeniorResearchScientist MerckResearchLaboratories Dec 2002 Keytakeaways Rapidmovementtocell basedassaysforcontextualanalysis 以细胞为主要研究对象的课题数量变化 细胞水平研究的历史 现在和未来 暗视野光镜 相差显微镜 微分干涉对比显微镜 偏振光显微镜 荧光显微镜 单光子共聚焦显微镜 多光子共聚焦显微镜 大体荧光成像系统 细胞计数仪 18世纪 明视野显微镜发明 流式细胞仪 分光高度计 荧光高度计 干涉光高度计 放射自显影 细胞成像定量分析系统 形态学研究工具的发展历程 Simpleopticalmicroscope Basicclinicalscope Researchgradefluorescencescope High endautomatedHCSsystems Confocalscanningsystem 细胞定量工具发展历程 Simplecellcounters sizers AutomatedCellviability 2 4colorcytometer simpleassays 5 6colorcytometer clinical high endres 6colorpluscytometer sorter high endres CellLabQuanta 流式细胞仪新技术趋势 Multi colorAnalysisRedsensitivePMTsExcellentSensitivityNewopticslayoutforSharpnessMulti platformsamplingandhumanitydevicesAutoSetupwithbiologicalsampleOff linecompensation LMDcompensationandMoreFCS3 0formatforListmodefilesSolventproteindetectiondevelopment beadsbasedassay Multi Laser multi poweroptionsfordifferentuseLargeandSmallparticlesortingNewtechnologiesforhighyield highpurityandhighviabilitysorting 32支试管自动上样盘 MCL Walkaway独立获取样本 减轻操作劳动MCL自动模式 MCL手工模式 单管上样模式 暂停 转动功能可以方便地往试管加入刺激剂或终止剂进行试验每支试管检测前单独震动混匀 有利于均匀获取细胞 自动上样方式 FC500MPL24孔0 5 2 5ml每孔容量96标准孔和深孔反应板250ul最小容量40支试管 12x75mm 1ml最小体积可以固定体积上样检测175ul吸样量 可以减少高通量工作需要的烦杂的取样过程适合于零成本绝对计数将您的注意力从操作中解放出来 而集中于思路的创新 从模拟信号到先进的数字化信号 数字化信号转换对数查表保证最优化的线性和稳定性4次幂转换误差 1 光纤通讯速度快保真性高实时获取数据和分析报告结果20比特的数据 补偿数字化全矩阵正反补偿离线补偿 线性对对数查表VS普通对数放大 从相邻相邻相减到减法全矩阵到正反全矩阵数字化补偿方法 自动设置功能 实时自动补偿每个通道电压自动调整2 5色全自动补偿以细胞而不是微球进行自动荧光交叉和重叠的计算可以根据不同的应用而分别设置利用20比特的数据进行数字化补偿 实时手工补偿全矩阵正反补偿20比特未补偿的原始数据能提供LMD结果直接补偿获取后通过滑调调节迅速重新补偿20比特未补偿或补偿不好的原始数据可重新离线补偿在相同电压条件下进行自动设置生成相应的补偿文件利用补偿文件进行LMD结果的重新播放可以进行单个文件和批处理文件的重新补偿 特别适用于三色以上补偿 准确方便适用于三色以下补偿和提供多色人工修正补偿的机会对于分群明显但补偿不好的文件可以在结果中直接补偿对于稀有标本或复杂实验 发现结果不好时不必进行实验的重新操作而可以用离线补偿进行抢救数据 离线补偿后得到的补偿文件应用于LMD文件进行重新补偿 离线补偿自动设置后得到的设置文件应用于新样本的获取 FC500离线补偿界面 从其它系统到Windows系统多种方式的图形重叠点击将结果输出至WORD PPT文件点击将结果直接以EXCEL结果输出点击将结果直接以PDF格式输出 操作平台和结果输出的变化 FCS3 0文件包含20比特的原始数据 10比特获取时经过补偿的数据和获取时的方案可以直接以LMD结果文件来获取新的样本分析时不须预先打开方案 而可以直接打开LMD结果文件进行分析可以重新进行补偿 LISTMODE文件格式数据量的变化 细胞在进入流动室之前已经经过流体力学聚焦形成分散独立的颗粒 流动室两边电极产生电流 细胞通过时产生的电阻可以用来计数细胞和体积 大小 引入全新的细胞参数 如精确细胞大小测定 增加不同的前向角收集角度 5种主要的激发波长提供了分析包括紫外光在内的灵活的分析方式 特殊光源 特别是UV和大功率激光 的应用 大功率紫外激光 5 16 25 100 体积增加 直径增加 直径vs 体积 本图所示说明了体积分析对细胞大小的分析的敏感性远远超过前向角散射光分析 ECVFS 前向角散射光分析vs 体积分析 QUANTA 联合体积分析和荧光分析的优势 其它经典CYTOMETER NormalNuclei MalignantNuclei NPEAnalysis NPEAnalysis NPE 5 8 NPE 16 0 NPE 核质包装效率 Wheredoyouseparateviable nonviable 体积参数对死活细胞的良好分群 Quanta是目前市场上分析精度最高的分析工具 能用的染料最多 并且能同时得到细胞大小的精确信息 4 407565 528 530 902 7 74 1 554 129 5 6 3 G2 11 78082 353 408 461 24 64 4 947 108 8 5 9 S Phase 5 901847 290 295 862 57 93 11 633 82 5 4 G1 Color CV1 Mode1 Mean1 Pct Counts MCV Diameter RegionName DNAdyesusedontheQuantaInclude DAPIPropidiumIodideDraq5Hoechst7 AAD 体积参数在分析细胞周期中的作用 经典的免疫系统细胞分析 INNATEPMNNUETROPHILSEOSINOPHILSBASOPHILSMONOCYTES MACROPHAGESDENDRITICCELLS mDC pDCNKCELLSNKTCELLSgdTLYMPHOCYTESCD5 BCELLS ADAPTIVEBCELLSHELPERT CELLSTh1Th2REGULATORYT CELLS Th3 CYTOTOXICT CELLS 两群树突状细胞 MDC PDC 先天免疫细胞分析 NK细胞 多色分析离我们越来越近 越来越多的细胞缺乏特异性标记 需要越来越多的标记来限定 多色分析的优势是2 1 1 3 2 1 3 1 1 1 ETC 节省试剂和工作量 如果做非常全面的免疫分型 三色需要20支试管 四色需要12支 而五色只需要6支 越来越多的生命活动研究需要多参数多角度分析 例如凋亡 AICD等 抗原特异性T细胞分析 四聚体 tetramer 染色细胞因子分泌试验ELISPOTCytokineSecretionAssay 不同厂家的MHC四聚体产品不太一样 贝克曼库尔特公司创造性地构建和表达了MHC分子 3链的区域突变的蛋白 iTAg 能降低其与非特异性T细胞结合 大大提高了特异性 并且将MHC四聚体直接标记荧光 和常用的抗原多肽负载后整体商品化 也有单独的MHC分子 iTAg 单独出售 极大方便了研究者利于此技术关键问题在四聚体制备 最大的问题不是没有阳性细胞 而是阳性率太高 四聚体染色技术 BeckmanCoulter已经有的部分产品 传染性疾病相关 HIVgag SLYNTVATL HLA A 0201 HIVpol ILKEPVHGV HLA A 0201 CMVPP65 NLVPMVATV HLA A 0201 EBV GLCTLVAML HLA A 0201 EBV GLCTLVAML HLA A 0201 InfluenzaM1 GILGFVFTL HLA A 0201 HBVcore FLPSDFFPSV HLA A 0201 肿瘤性疾病相关 Mart1 ELAGIGILTV HLA A 0201 Gp100 IMDQVPFSV HLA A 0201 Gp100 ITDQVPFSV HLA A 0201 Her 2 neu KIFGSLAFL HLA A 0201 Her 2 neu RLLQETELV HLA A 0201 PR 1 VLQELNVTV HLA A 0201 Tyrosinase YMDGTMSQV HLA A 0201 抗原决定簇分析的科学平台 iTopiaEpitopeDiscoverySystem 在目前主要以数据库为基础的理论性分析抗原决定簇的基础上 iTopia技术平台为研究者研究免疫的发生发展 疫苗的研制和免疫学检测提供了一个科学合理的解决方案 分泌细胞因子的细胞的检测和分选 DC与TLR分子和T细胞的相互作用 DCCaptureAgViaTLRInducedActinRemodelingTLRactivateDCendocytosis FITC dextranincubationMatureDCPrimingNa veTCells 贝克曼库尔特公司PLG试剂能测定保存长达5天的陈旧血 世界首先专利特殊的克隆号和抗体保存秘方更多的此类抗体即将问世 贝克曼库尔特公司BBA试剂能同时检测10种细胞因子 HumanTh1 Th2CytokineIKit FL2 ReporterParameter FL4 DifferentiatorParameter Cells Beads 细胞表面标记和样本可溶性蛋白同时检测系统 单种可溶性蛋白 Beads Cells 细胞表面标记和样本可溶性蛋白同时检测系统 多种种可溶性蛋白 干细胞中的研究应用 Hoechst33342sidepopulation 干细胞能表达ABCG2泵蛋白 在HOECHST33342染色时能将该染料泵出 因此分析不能被该染料染色的细胞群时可以发现一群不能染色的细胞既是干细胞 因此能够在众多肿瘤细胞中区分出肿瘤干细胞 QUANTA检测SP细胞群 EPICSAltra测定SP细胞群 流式细胞仪对细胞结构的分析 细胞酶活性检测 Th1细胞DPPIV活性实时检测与验证 神经元细胞融合检测 利用DIL DIO对神经元细胞进行染色观察和流式检测 流式细胞术在生物医学研究的新方向 细胞多态性分析 受体 抗原折叠 HLA等 包括CXCR