遗传学的中心法则.ppt

遗传信息传递中心法则 转录翻译DNARNA蛋白质反转录复制 复制 第十章 DNA的生物合成 复制 DNABiosynthesis Replication 复制 replication 是指遗传物质的传代 以母链DNA为模板合成子链DNA的过程 亲代DNA 复制 子代DNA 复制 分子基础 碱基配对规律和DNA双螺旋结构 化学本质 酶促的生物细胞内单核苷酸聚合 复制的保证 各种酶和蛋白质因子的参与 复制的基本规律BasicRulesofDNAReplication 第一节 半保留复制semi conservativereplication 半不连续复制semi discontinuousreplication 复制方向为双向bidirectionalreplication 高保真性复制highfidelity 复制的特点 一 半保留复制的实验依据和意义 DNA生物合成时 母链DNA解开为两股单链 各自作为模板 template 按碱基配对规律 合成与模板互补的子链 子代细胞的DNA 一股单链从亲代完整地接受过来 另一股单链则完全从新合成 两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致 这种复制方式称为半保留复制 一 半保留复制的概念 二 半保留复制的理论设想 TGGTACTGCCACTGG ACCATGACGGTGACC TGGTACTGCCACTGG ACCATGACGGTGACC CCACTGG GGTGACC TGGTACTG ACCATGAC ACCATGAC TGGTACTG TGGTACTGCCACTGG ACCATGACGGTGACC 母链DNA 复制过程中形成的复制叉 子代DNA 三 子链继承母链遗传信息的几种可能方式 全保留 半保留 混合式 亲代DNA 子代DNA 四 半保留复制的证明 实验 细菌可以利用NH4Cl作氮源合成DNA 轻链14N DNA 重链15N DNA 轻 重链DNA混合 半保留复制第一代DNA 半保留复制第二代DNA 半保留复制第三代DNA 细菌在含NH4Cl的普通培养液中培养后提取DNA 把细菌放在含15NH4Cl的培养液中培养若干代后提取含15N的 重 DNA 把含15N DNA的细菌放回含NH4Cl的普通培养液中培养20分钟后提取子一代DNA 把含15N DNA的细菌在含NH4Cl的普通培养液中培养40分钟后提取子二代DNA 将轻链DNA和重链DNA混合 把含15N DNA的细菌在含NH4Cl的普通培养液中培养60分钟后提取子三代DNA 普通培养液培养细菌的轻链DNA在密度梯度离心时区带在离心管上方 子二代DNA密度梯度离心分析时有介于重带与轻带之间的中间带轻带两种 将轻链和重链DNA混合后密度梯度离心时在离心管中有与轻 重链对应的两条区带 子三代DNA密度梯度离心分析时仍有中间带和轻带两种 以后各代DNA分子密度梯度离心结果相同 但轻带变浓而中间带逐渐被稀释 含15NH4Cl培养液培养的重链DNA在密度梯度离心时区带在离心管下方 子一代DNA密度梯度离心分析时致密带介于重带与轻带之间 没有单独的重带和轻带 实验结果说明 子一代DNA双链中一股是15N单链 从亲代接受和保留下来的 另一股是14N单链 完全是新合成的 Messelson和Stahl的实验支持半保留复制 半保留复制的意义按半保留复制方式 子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致 即子代保留了亲代的全部遗传信息 体现了遗传的保守性 遗传的保守性是物种稳定性的分子基础 但不是绝对的 在强调遗传恒定性的同时不能忽视其变异性 二 双向复制 原核生物DNA复制时 DNA从起始点 origin 向两个方向解链 形成两个延伸方向相反的复制叉 称为双向复制 复制中的放射自显影图像 眼睛状图形 大肠杆菌DNA经放射性标记后电镜下观察结果 复制叉指的是DNA双链分成两股各自作为模板 子链沿模板延长形成的Y字形结构 复制叉指的是DNA双链分成两股各自作为模板 子链沿模板延长形成的Y字形结构 真核生物 真核生物有多个染色体均需要复制 每个染色体有多个起始点 是多复制子的复制 习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子 replicon 复制子是独立完成复制的功能单位 高等生物有数以万计的复制子 长度差异很大 原核生物是单复制子复制 称为复制体 replisome 真核生物的多复制子复制 已完成复制的复制子 DNA母链 ori为复制点 复制子的大小和起始的先后不同 复制子长度为相邻起点间距离其中一个复制子已经完成复制 复制进程 三 复制的半不连续性 5 3 解链方向 领头链 leadingstrand 随从链 laggingstrand 领头链连续复制 随从链不连续复制 这就是复制的半不连续性 DNA的两股单链走向相反 一股为5 至3 另一股 互补链 为3 至5 复制叉上两股母链也是走向相反 子链沿母链模板复制 只能从5 向3 延伸 同一个复制叉上只能有一个解链方向 顺着解链方向生成的子链 复制是连续进行的 这股链称为领头链 另一股链因为复制的方向与解链方向相反 不能顺着解链方向连续延长 这股不连续复制的链称为随从链 冈崎片段 复制中的不连续片段称为岡崎片段 okazakifragment 第二节 DNA复制的酶学TheEnzymologyofDNAReplication 参与DNA复制的物质 DNA复制系统 底物dNTP 聚合酶DNA pol 模板解成单链单链的DNA母链 引物与模板互补的RNA片段 其它酶和蛋白质因子 底物 substrate dATP dGTP dCTP dTTP 聚合酶 polymerase 依赖DNA的DNA聚合酶简写为DNA pol 模板 template 解开成单链的DNA母链 引物 primer 提供3 OH末端使dNTP可以依次聚合 解螺旋酶引物酶单链DNA结合蛋白DNA连接酶等 一 复制的化学反应 单链延长的方向 单链延长的方向 dNMP n dNTP dNMP n 1 PPi 新链生成需引物 新链的延长只可沿5 3 方向进行 脱氧核糖核苷酸之间生成3 5 磷酸二酯键而逐一聚合 二 DNA聚合酶 全称 依赖DNA的DNA聚合酶 DNA dependentDNApolymerase 简称 DNA pol活性 作用 有两方面 5 3 的聚合活性 延5 3 方向延长脱氧核苷酸链 核酸外切酶活性 两种情况 3 5 外切酶活性 能辨认错配的碱基对 并将其水解 5 3 外切酶活性 能切除突变的DNA片段 核酸外切酶活性 3 5 外切酶活性能辨认错配的碱基对 并将其水解 5 3 外切酶活性能切除突变的DNA片段 合成中的DNA分子 一 原核生物的DNA聚合酶 DNA pol DNA pol DNA pol 三种酶共同点 都具有5 3 聚合酶活性3 5 外切酶活性 二 真核生物的DNA聚合酶 分子量 kD 5 3 聚合活性 3 5 外切活性 功能 16 5 40 14 0 12 5 25 5 中 起始引发引物酶活性 高 高 高 低保真度的复制 线粒体DNA的复制 延长子链的主要酶解螺旋酶活性 填补引物空隙切除修复重组 三 复制保真性的酶学依据 复制按照碱基配对规律进行 使遗传信息能准确传代 二 复制的保真性DNA聚合酶对模板的依赖性是子链与母链准确配对 是遗传信息得以延续和传代的保证 碱基配对的关键是氢键的形成 三 聚合酶对碱基的选择原核生物DNA聚合酶III对核苷酸的参入有选择功能 复制保真性的酶学机制 一 DNA pol有两种活性聚合酶活性核酸外切酶活性和即时校读 2 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能 1 遵守严格的碱基配对规律 3 复制出错时DNA pol的及时校读功能 DNA复制的保真性至少要依赖三种机制 四 复制中的分子解链及DNA分子拓扑学变化 DNA分子的碱基埋在双螺旋内部 只有把DNA解成单链 它才能起模板作用 一 解螺旋酶 引物酶和单链DNA结合蛋白 二 DNA拓扑异构酶 DNAtopoisomerase 拓扑异构酶作用特点既能水解 又能连接磷酸二酯键 曾用名 11个螺旋 超螺旋局部解开后 DNA复制过程中正超螺旋的形成 复制过程中正超螺旋的形成 超螺旋解开前 2 9 拓扑异构酶 切断DNA双链中一股链 使DNA解链旋转不致打结 适当时候封闭切口 DNA变为松弛状态 反应不需ATP 拓扑异构酶 切断DNA分子两股链 断端通过切口旋转使超螺旋松弛 利用ATP供能 连接断端 DNA分子进入负超螺旋状态 拓扑异构酶的作用 五 DNA连接酶 DNA连接酶 DNAligase 作用方式 连接DNA链3 OH末端和相邻DNA链5 P末端 使二者生成磷酸二酯键 把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链 DNA连接酶功能在复制中起最后接合缺口的作用 在DNA修复 重组及剪接中也起缝合缺口作用 也是基因工程的重要工具酶之一 第三节DNA生物合成过程TheProcessofDNAReplication 一 复制的起始 需要解决两个问题 1 DNA解开成单链 形成复制叉 提供模板 2 形成引发体并合成引物 提供3 OH末端 一 原核生物的DNA生物合成 E coli复制起始点oriC 1 DNA解链 解链过程 DnaA B C三种蛋白参与 DnaB解螺旋酶 DnaC DnaA蛋白四个相同亚基组成 2 引发体和引物 DnaA SSB 含有解螺旋酶 DnaC蛋白 引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体 DnaG引物酶 DNA拓扑异构酶 SSB DnaG引物酶 DNA拓扑异构酶 合成引物 引物的合成 3 5 5 3 SSB DNA拓扑异构酶 合成引物 DnaG引物酶 解链方向 引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子 二 复制的延长 复制的延长指在DNA pol催化下 dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上 其化学本质是磷酸二酯键的不断生成 DnaG DNA Pol 前导链 后随链 冈崎片断 随从链 领头链 3 复制的过程 解螺旋酶 拓扑异构酶 单链DNA结合蛋白 DNA Pol DNA连接酶 原核生物基因是环状DNA 双向复制的复制片段在复制的终止点 ter 处汇合 三 复制的终止 冈崎片断的连接 5 5 RNA酶 水解RNA引物留下空隙 填补引物水解后留下的空隙 保留缺口 形成磷酸二酯键连接片段之间缺口 二 真核生物的DNA生物合成 细胞周期 Cellcycle 指细胞分裂的时相变化 典型的细胞周期分为4期 G1期 DNA合成前期 S期 细胞分裂的合成期 合成DNAG2期 G2期主要合成一些与有丝分裂中新细胞形成所必需的物质 M期 细胞染色体形成并发生细胞分裂 新细胞在此期形成 体内活细胞周期长短相差悬殊 关键在G1进入S期 营养良好的培养细胞周期约24小时 真核生物DNA复制特点 不同染色体各自进行复制每个染色体有上千个复制子 复制起点多复制有时序性复制子以分组方式激活而不是同步启动转录活性高的DNA在S期早期就开始复制卫星DNA 高度重复序列 中心体 连接染色体双倍体的部位 端粒 线性染色体两端 在S期最后复制复制起始点比大肠杆菌起始点OriC短复制起始需要DNA Pol 引物酶 解螺旋酶 拓扑酶 复制因子 replicationfactor RF 增殖细胞核抗原 proliferationcellnuclearantigen PCNA 参与 一 真核生物复制的起始 复制起始也是打开复制叉形成引发体并合成RNA引物 但详细机制不清楚 细胞能否分裂 决定于进入S期及M期这两个关键点 G1 S及G2 M的调节 与蛋白激酶活性有关 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用 相关的蛋白激酶 具有四级结构的蛋白质 有两类亚基 调节亚基 细胞周期蛋白 cyclin 催化亚基 细胞周期蛋白依赖激酶 cyclindependentkinase CDK 二者都有多种 而且可以交叉配伍 实现对DNA复制的多样化和精确的调节 哺乳类动物细胞内还发现天然抑制CDK的蛋白 锚蛋白 ankynin 抑制CDK4P21蛋白 抑制多种CDK 还抑制PCNA 还参加P53介导的细胞凋亡级联反应 P21和锚蛋白被称为细胞检查点蛋白 领头链 随从链 二 真核生物复制的延长 当随从链延长了一个或多个核小体的长度后要重新合成引物 亲代DNA 真核生物DNA复制与核小体组装同步进行 复制完成后随即组装成染色体并从G2过渡到M期 染色体DNA呈线状 复制在末端停止 复制中岡崎片段的连接 复制子之间的连接都可以在线性DNA内部完成 染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物 去除后留下空隙 剩下的DNA单链要填补成双链 否则会被核内的DNase水解变短 三 真核生物复制的终止 线性DNA复制的末端 复制完成后子链末端留下空隙 母链成单链 端粒 telomere 指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构 形态学上染色体DNA末端膨大成粒状 结构特点由末端单链DNA序列和蛋白质构成 末端DNA序列是多次重复的富含G C碱基的短序列 仓鼠和人类端粒DNA末端都有 TnGn x重复序列 功能维持染色体的稳定性 维持DNA复制的完整性 端粒酶 telomerase 组成端粒酶RNA humantelomeraseRNA hTR 端粒酶协同蛋白 humantelomeraseassociatedprotein1 hTP1 端粒酶逆转录酶 humantelomerasereversetranscriptase hTRT 功能提供RNA模板 催化逆转录端粒酶通过爬行模型的机制维持染色体的完整 端粒DNA末端 1 端粒酶靠hTR AnCn x与母链DNA端粒结合 内在模板RNA 2 以端粒酶RNA为模版 逆转录 延长DNA母链 3 端粒酶移位 空出RNA模板 再次延长母链 同时DNA母链反摺利于下游复制延伸 4 延伸足够长度后端粒酶脱离母链 代之以DNA Pol 此时母链3 OH反折 同时作为引物和模板 完成末端双链复制 DNA Pol 第四节 逆转录和其他复制方式ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWays 双链DNA是大多数生物的遗传物质 某些病毒的遗传物质是RNA 少数低等生物如M13噬菌体的感染型只含有单链DNA 染色体外DNA 原核生物的质粒 真核生物的线粒体 都采用特殊的方式复制 逆转录或反转录 reversetranscription 逆转录酶 reversetranscriptase 全称 依赖RNA的DNA聚合酶 RNA DNA 逆转录酶 一 逆转录病毒和逆转录酶 信息流动方向 逆转录酶作用特点 逆转录酶具有三种酶活性 以RNA作模板的dNTP聚合活性以RNA作模板合成DNA单链 形成RNA DNA杂化分子RNase活性水解杂化分子中的RNA单链 生成DNA单链模板 此作用可以由被感染细胞内RNase代替 以DNA为模板的的dNTP聚合活性DNA作模板合成DNA单链 形成双链DNA分子酶作用需要Zn2 作为辅助因子合成反应也按照5 3 延长的规律逆转录酶的存在 致癌RNA病毒 蛙卵 白细胞 滋养层细胞 逆转录酶的作用 逆转录酶 逆转录酶 RNaseH 逆转录酶 RNA模板 DNA RNA杂化双链 单链DNA 双链DNA 逆转录病毒在细胞内的逆转录现象 tRNA引物 RNA单链模板 RNA DNA杂化双链 DNA单链 DNA双链前病毒 与宿主基因组DNA整合 分子生物学研究可应用逆转录酶 作为获取基因工程目的基因的重要方法之一 此法称为cDNA法 以mRNA为模板 经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链 试管内合成cDNA cDNA complementaryDNA 逆转录酶 SI核酸酶 DNA聚合酶 碱水解 二 逆转录研究的意义 逆转录酶和逆转录现象 是分子生物学研究中的重大发现 逆转录现象说明 至少在某些生物 RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能 对逆转录病毒的研究 拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论 三 滚环复制和D环复制 滚环复制 rollingcirclereplication 是某些低等生物的复制形式 如 X174和M13噬菌体等 不需要引物 D环复制 D loopreplication 是线粒体DNA mitochondrialDNA mtDNA 的复制形式 复制时需要合成引物 第五节DNA损伤 突变 与修复DNADamage Mutation andRepair 遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变 均可称为突变 分子水平上的突变就是DNA上碱基的改变 在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤 DNAdamage 一 突变的意义 一 突变是进化 分化的分子基础 二 突变导致基因型改变 三 突变导致死亡 四 突变是某些疾病的发病基础 突变就其后果而言并非都是危害生命的 也有积极意义 且在生物界普遍存在 二 引发突变的因素 物理因素紫外线 ultraviolet UV 各种辐射UV可以导致DNA分子上相邻的两个嘧啶碱基发生共价交联 生成嘧啶二聚体 环丁基环cyclobutanering 化学因素很多的化学诱变剂同时就是致癌剂 化学诱变剂的来源 1 化工原料 化工产品 化工副产品 2 工业排放物 汽车排放的废气 3 农药 食品防腐剂或添加剂 目前已经检出6万多种 而且每年增加超过千种 4 物质代谢过程中产生的自由基等因素能直接损伤DNA或干扰DNA的复制过程 确定致癌物的检测方法 检测该物质是否对细菌有突变作用 Ames试验 试验选用有缺陷的沙门菌 1 His 组氨酸异养型必须加入组氨酸才生长 2 细胞壁缺陷