诱导痰在气道炎症评价中的应用.doc

诱导痰检测的方法学及其在气道炎症评价中的应用 罗炜 综述 赖克方 钟南山 审校 【摘要】 气道炎症在哮喘、慢性支气管炎和间质性肺炎等一系列疾病中扮演着重要的角色，而且被认为是导致气道结构改变的主要因素之一。诱导痰检测作为一种无创、安全和可靠的气道炎症评价方法正日益受到重视和利用。关键词? 诱导痰；气道炎症；哮喘；慢性阻塞性肺部疾病气道炎症在哮喘、慢性支气管炎和间质性肺炎等一系列疾病中扮演着重要的角色，而且是导致气道结构改变的主要因素之一。气道炎症的评估对于研究气道疾病的发病机制起着重要作用。而且，能发现无临床症状、无气道高反应性和肺功能正常的早期气道疾病1。以往，气道炎症通常用纤维支气管镜取材进行评价，但由于其属于有创检查，难以重复进行，使其应用受到限制2。 痰液检查已经有100多年的历史，最初主要用于肺结核和肺肿瘤的诊断。未经处理的痰液涂片，细胞分布不均，而且混在粘液中不易识别，使痰细胞学检查的准确性受到影响。1958年Bickerman 等3首次建立了诱导痰检测方法，对不能自然咳痰的患者进行高渗盐水雾化获得痰液，利用二硫苏糖醇（DTT）等粘液溶解剂对痰进行处理，消除粘液的影响。1992年Pin等4 首先开始用诱导痰分析哮喘患者的气道炎症状况。近年来，诱导痰检测作为一种无创、安全和可靠的气道炎症评价方法正日益受到重视。下面就诱导痰检测的方法学及其在气道炎症评价的应用作一综述。 1? 方法学 在Pin和Fahy两种方案4，5 的基础上，诱导痰检测方法经过多年的发展和改进，现已基本成熟，但各家报导的方案稍有不同。下面就目前常用的痰液诱导和处理程序作一简介。 1.1? 痰液的诱导? 诱导前10分钟让病人吸入喘乐宁（沙丁胺醇气雾剂），随后检测一秒最大呼气量（FEV1），当FEV170%，对病人进行自然咳痰或等渗盐水诱导处理，反之使用高渗盐水诱导。常用的盐水雾化程序有两种：单一浓度高渗盐水进行长时间的诱导；梯度高渗盐水从低浓度到高浓度间断的短时间诱导，两种方法总的诱导时间都小于30分钟。单一法的盐水浓度常采用4%或4.5%，该方法具有操作简便、盐水对痰中细胞和可溶成分的影响可估量等优点。梯度法常采用3%、4%、5%作为诱导浓度，此方法虽然操作繁复，较难估量盐水对痰中细胞和可溶成分的影响，但能通过诱导间隔进行FEV1检测，选择是维持相同浓度还是采用下一个梯度浓度继续诱导，如果FEV1降低超过20则终止诱导，提高诱导的安全性和成功率。也有研究者选用5%、7%、9%作为梯度浓度。痰液诱导过程还要注意采用各种方法，尽量减少唾液对痰的污染和稀释6，由于肥大细胞在高渗溶液和Ca2+存在的环境中容易被激活并释放组胺，所以研究肥大细胞时应尽量避免采用高渗盐水进行诱导或通过咳痰前的漱口来减少痰液中高渗盐水的残留量 7。痰液诱导出来后必须进行细胞分类和活力检测，合格标准一般为上皮细胞40%。 另外据文献报道甘露醇和5三磷酸盐尿嘧啶也可作为诱导物8，9，但由于甘露醇具有较明显的刺激支气管收缩作用，对于哮喘病人不适用，临床通常将其作为激发试验的刺激物使用。尿嘧啶一方面能刺激气道上皮P2Y2受体，打开Cl通道，使分泌物穿越粘膜进入气管腔，另一方面促进粘膜下的腺体和杯状细胞分泌粘液，同时增加气道纤毛的清理作用，与高渗盐水诱导相比，痰量增加了一倍，而患者的SaO2和PEF等指标的下降比高渗盐水诱导明显降低，同时两种方法的痰细胞总数和分类的结果相近。由于尿嘧啶诱导法具有以上优点，有望成为一种评价呼吸系统疾病特别是哮喘的气道炎症的手段，具有一定的应用前景。 1.2? 痰液的处理? 当前痰的处理主要有两种方法，一种是全取法10 ，即收集患者咳出的全部痰，另一种是选取法11，即挑选痰栓或痰的粘稠部分进行处理。据Antonio报道12，选取法的细胞存活率（80.6%）、嗜酸粒细胞比例（15.3%）和嗜酸粒细胞阳离子蛋白（ECP）浓度（548ug/L）显著高于全取法的细胞存活率（71.8%）、嗜酸粒细胞比例（8.3%）和ECP浓度（105ug/L），而选取法的中性粒细胞比例（33.3%）则显著低于全取法（42.7%），使用上述两种方法对正常人的痰进行处理时，亦显示选取法优于全取法。 由于嗜酸粒细胞主要分布在痰栓中，加入和痰等体积的0.1%DTT或其光学异构体DTE漩涡震荡2分钟，37水浴15分钟能有效地溶解粘液，使痰均匀化以便进行检测。实验证明13在室温或37下，DTT都能提高细胞和可溶物质的检测质量，而且不会刺激嗜酸粒细胞释放ECP，嗜碱粒细胞和肥大细胞释放组胺；并在不影响细胞分类计数的前提下，提高细胞的回收率；对细胞因子的检测也无干扰。 2? 可行性和安全性 由于高渗盐水是支气管激发剂，对病人特别是未完全控制的哮喘或慢性气道阻塞患者进行诱导时有一定危险性。据Vlachos-Mayer报道14，由熟练的研究人员严格按照操作规范对304例哮喘和25例慢阻肺患者进行痰诱导，73%的患者使用小于5%的高渗盐水，其中又有28%的患者使用生理盐水，成功率可达93%，只有8%的哮喘患者FEV1降低超过20%，而这些患者在诱导完成后吸入舒喘宁（200ug-400ug），FEV1都在30分钟内基本恢复到诱导前水平。另据Anneke报道15，使用0.9%、3.0%和4.5%梯度盐水对93例重症和难控制性哮喘患者进行痰诱导，成功率也能达到74%，只有22%的患者FEV1降低超过15%。以上报道与其他文献16共同提示诱导痰技术对于临床研究气道炎症是一种较安全和成功率较高的检测手段。需要强调的是，诱导前必须准备好相关的抢救设备和药物，诱导过程必须小心处理，如果病人出现呼吸道不适症状，建议马上终止诱导。 3.? 有效性与重复性 正常人和哮喘、慢阻肺病人的痰细胞成分、炎症介质和细胞因子等存在明显区别。由于PBS灌洗液对支气管肺泡灌洗液（BALF）造成不同程度的稀释，所以对炎性介质和细胞因子等检测受到限制。痰与BALF相比，含有更多的中性粒和嗜酸粒细胞，较少的单核和淋巴细胞。痰嗜酸粒细胞分类与支气管灌洗液、BALF的嗜酸粒细胞分类相关性较好。据Pin 和 Spanavello报道，在同一诱导技术的前提下，不同时间里对症状稳定的患者进行痰细胞分类和痰内可溶性介质检测，其重复性除了淋巴细胞之外都非常好，相关系数分别达到0.7和0.6以上17,18。 4.? 应用 4.1? 诊断方面? 痰是呼吸道粘膜的分泌物，主要成分是粘液和细胞。据Belda报道正常痰液细胞主要是吞噬细胞(61%)和中性粒细胞(36%)，嗜酸粒细胞和淋巴细胞较少见19。细胞分类计数的异常提示不同的气道炎症和诱因。研究表明嗜酸粒细胞增高(3%)是支气管哮喘、嗜酸粒细胞支气管炎和过敏性疾病20，21的特征性标志，同时痰细胞计数是嗜酸粒细胞支气管炎的主要诊断依据22。而且痰嗜酸粒细胞比起血清ECP，更能灵敏和准确地反映哮喘患者的气道炎症状况23。它不但能反映哮喘发病的进程，并与气道阻塞和气道高反应性成正相关。哮喘发作时痰嗜酸粒细胞呈二至三倍的增长24,25，同时痰ECP、IL-5也伴随有显著的增高，随着过敏原的消失或吸入激素治疗后，痰嗜酸粒细胞和ECP也会随之减少。痰和血清ECP的浓度并无相关性，当痰ECP伴随症状改善而下降时血清ECP浓度并无改变。这些研究结果提示痰嗜酸粒细胞和其脱颗粒产物的水平对于描述炎症的程度有重要作用。由于肥大细胞、嗜酸粒细胞和淋巴细胞在哮喘的气道炎症特征如支气管痉挛收缩、气道阻塞和气道高反应上扮演重要的角色，所以检测痰粘液中上述细胞的产物有助于哮喘的诊断和发病机理的研究。据Birring报道CVA和EB病人的诱导痰中组胺、白三烯、前列腺素D2、E2和白介素8与正常人相比都有显著差异26。但由于炎症介质和细胞因子的检测容易受到痰处理过程的各种因素的干扰而且费用昂贵，通常不作为疾病诊断的首选指标。另外如果利用上下班不同时段对诱导痰进行连续监测，该技术还可应用于职业性哮喘的研究27。 COPD患者痰内主要是中性粒细胞， Keatings和Thompson研究发现呼吸道内中性粒细胞浸润程度达到70%28,29，BALF里中性粒细胞是正常人的二至三倍29,30。中性粒细胞可以产生大量的弹性蛋白水解酶，导致肺实质的弹性纤维破坏和弹性下降，最终导致肺气肿。患有气道阻塞的患者其严重程度与痰中性粒细胞的百分比成正比。小气道和肺泡管是COPD患者气道阻力增加的主要部位31，该部位炎症的变化与气道的阻塞相关联32。可以肯定诱导的痰液包含着下呼吸道的物质，所以诱导痰是一种研究COPD气道炎症的有用工具。 目前世界卫生组织建议将在呼吸道分泌物中找到抗酸杆菌作为诊断肺结核的首要依据，但由于该方法的敏感性不高而且有相当部分的疑似病人不能自然咳出合格的痰而局限了该方法的应用。Conde等人33发现通过诱导痰这种无创的，安全的方法能解决上述无法自然咳痰的问题，而且结果与纤维支气管镜取材结果相一致，从而能大大提高结核的检出率。 对于肺癌病人，最佳的防治方案是能在早期或者症状出现前确诊。Vignola发现34通过检测诱导痰其特异性的致癌基因、抑癌基因表达、基因组的不稳定性和异常甲基化等指标，有可能在患者临床诊断肺癌前几年即可以分子生物学方法进行诊断。 4.2? 治疗方面? 由嗜酸粒细胞或中性粒细胞引起的不同炎症，其治疗方案各有不同。慢性咳嗽、哮喘或COPD患者的痰嗜酸粒细胞数量常预示其对激素治疗效果的好坏35。伴有嗜酸粒细胞增多的慢性咳嗽和COPD对吸入激素治疗效果显著，足量的激素治疗可使嗜酸粒细胞降低到正常水平，但非嗜酸粒细胞增多的慢性咳嗽和COPD则一般对皮质类固醇无效36。通过观察嗜酸粒细胞数量衡量激素治疗效果的哮喘患者的要考虑几个因素，第一，病人的依从性；第二，病人生活或工作环境中是否存在频繁的变应原刺激；第三，激素治疗剂量不足；第四，诊断错误，是中性粒细胞而非嗜酸粒细胞性哮喘或激素耐受型哮喘。痰细胞计数在治疗由吸烟或肺气肿引起的慢性气道阻塞也有一定帮助37,38，痰嗜酸粒细胞的增高提示可用强的松改善症状，中性粒细胞的增高提示患者有感染，可施以抗菌治疗。 5.? 存在问题与展望 虽然诱导痰检测技术的优点有目共睹，但其不足之处也不容忽视。首先目前国内外尚无统一的诱导痰标准化处理方案,不同方案处理得出的结果有一定的差异39，影响资料的可比性和该方法的广泛利用。其二，由于处理过程中，盐水和唾液对不同标本的稀释度存在差异，或在测定痰液上清炎症介质时，DTT、蛋白酶或其它未知成分的复合物对免疫测定或其他检测程序的潜在干扰因素都会影响结果的可靠性，而且可溶性介质的正常范围也没确定，降低其对于临床的提示作用40。其三，由于痰液存放时间较短，4只能存放2小时，标本不能留待批量处理，而痰的诱导和处理过程手工步骤多、耗时较长等都是影响该方法作为常规检测项目的不利因素。 如何