水母毒素的研究进展 科技论文检索作业.doc

水母毒素的研究进展 14食工 李如平 146410090摘 要:概述水母毒素的心血管毒性、神经毒性、皮肤与肌肉毒性、细胞毒性、抗氧化活性及多种酶活性等。该毒素成分复杂、不耐热、易氧化, 在分离、纯化及生物学活性研究等方面受到限制, 因此制备高纯度、高活性水母毒素的新方法有待于探索开发。关键词:水母毒素;生物学活性 水母是一类低等的浮游动物 ,包括刺胞动物门(腔肠动物门)钵水母纲的全部和水螅虫纲的部分种类。水母的种类很多, 全世界已知约有 250 种 , 直径 10 100 cm , 广泛分布于温带、亚热带及热带海域 ,属海洋杂食性生物。水母的基本结构由伞部、口腕、触手、附器等组成, 生活史为水螅世代(无性世代)和水母世代(有性世代)的交替。有性世代的水母通过触手上的刺丝囊发射刺丝注入毒液来捕食轮虫、枝角类、桡足类、小鱼和蝌蚪等。肽类毒素是刺丝囊毒液的主要活性成分, 相对分子质量 10 600 kDa 1 , 毒性大, 是目前所知最毒的毒素之一。我国食用水母已有一千余年,是世界上最早利用水母的国家 ,水母在我国乃至整个东南亚地区具有重要的经济和药用价值。但是部分水母含有剧毒, 蜇伤后可出现皮肤划痕、红肿 ,腹痛 , 痉挛, 麻痹,心脏及呼吸衰竭甚至死亡等严重症状, 每年因水母蜇伤致死者屡屡出现 , 研究水母毒素中毒机理与防护措施具有重要意义。1.分离与纯化 水母毒素主要由一组多肽类物质组成,不耐热、易氧化 , 因此其分离、纯化都需在低温、还原条件下进行。此外,水母毒素极易黏附于各种玻璃器皿上 2 ,导致毒素分离、纯化难度加大 ,制备高纯度、高活性的水母毒素成为目前水母毒素研究的瓶颈 , 因此水母毒素在生物学活性与中毒机理方面的研究滞后于其它有毒生物的毒素研究。 收集含有大量刺丝囊的水母触手 ,通过匀浆、过滤和离心可以分离出完好的纯刺丝囊,用于下一步的粗毒提取。值得注意的是除主要分布于触手和口周的刺丝囊外 ,其他部位(如中胶层、无刺丝囊的触手提取物等)也含有一定量的毒性成分, 并可产生相关的生物学效应。因此, 必须将刺丝囊与其他组织有效分离开来,得到的刺丝囊纯度越高,保存越完整 ,越有利于粗毒及纯毒的制备和活性的保持 ,以及后续毒理和药理等方面的进一步研究。将刺丝囊在粗毒提取缓冲液(NEB)中重新配制成悬液 ,经超速离心、超声处理, 再离心得到的上清液即粗毒。为了使毒素蛋白保持稳定性和活性, 常在提取缓冲液中加入抗氧化剂(维生素 C 、安息香酸), 巯基保护剂(DTT , 甘油 ,蔗糖),螯合剂(EDTA ,EGTA)以及酶抑制剂(PM SF ,DFP)等 3 。检测粗毒活性之后 , 即可根据不同的目的进一步分离。常用方法是采用色谱技术结合 SDS -PAGE 等实验 , 分离到一条或数条电泳带确单一蛋白组分, 然后进行毒素蛋白的活性或序列研究。John 等 4 利用阴离子交换色谱法成功分离到 42 kDa 的溶血毒素CA H1 , 并测定其 N 末段序列XAADA-XSTDIDD/GIIG 。 Sanchez-Rodriguez 等 5利用低压液相色谱法对C .marsup iali 毒液进行分离 ,成功地提取出一种神经毒素和三种溶细胞毒素, 相对分子质量分别是 120 ,220 , 139 , 36 kDa 。Carrette 等 7 应用一种小的玻璃珠搅拌器 ,从刺丝囊中迅速提取出毒液,且不会出现其他方法带来的过度加热等问题。2007 年, Brinkman 和 Burnell 6 利用C.f leckri 毒素的多克隆抗体进行免疫印迹实验 ,对毒素蛋白表达量最大的蛋白条带进行序列测定和结构分析, 成功地分离到了两种 C.f leckri 毒素的溶血蛋白 ,这也是一种可行的提取方法 ,但就目前水母毒素研究而言,仅有澳大利亚在 C .f leckri 水母制备有多克隆抗体, 给该法的推广带来了一定的困难。2.水母毒素的生物活性 水母毒素成分复杂, 不同种间相差很大,毒性亦有差别 ,其生物学活性往往是以一种成分为主 ,多种成分综合作用的结果。目前研究发现的有心血管毒性、神经毒性、皮肤与肌肉毒性、多种酶活性以及抗氧化活性等。2 .1心血管毒性 水母毒素的心血管毒性是目前研究最多、也是最为致命的 ,主要包括心脏、血管和溶血活性。 家兔静脉注射立方水母(Box jelly f ish)毒素迅速出现高血压和心动过缓,大剂量(2 mg/kg)时出现低血压和循环衰竭,最终导致死亡。死亡动物伴有粉红色泡沫样痰,尸检可见双肺明显充血,表明死亡主要是因为左心室衰竭所致 , 而小剂量(1mg/kg)则不会出现上述症状 8 , 9 。毒液的心血管毒性易受钙通道阻滞剂的影响, 尼卡地平、维拉帕米等可明显减弱毒液的心血管毒性并降低实验动物的死亡率。推测水母毒素可以激活细胞膜上的 L 型钙通道 , 使其开放,细胞内钙增加,最终形成钙超载导致心肌细胞溶解坏死 10 。 但最近研究发现 P . phy salis 和 C .f leckeri 毒素可以在细胞表面形成非特异性通透二价阳离子的孔道复合物(pore -forming complex),介导细胞外阳离子内流 ,而不是先前所说的 L 型钙离子通道复合物 11 , 12 。此外还有研究表明交感神经过度兴奋, 儿茶酚胺的过度释放间接导致了水母的心血管毒性 ,这在 Irukandji 综合征中表现的尤为明显。具体的作用机制尚无定论,很有可能是不同水母毒素间由于成分的不同而产生不同的效应。自 Nagai 等 13 , 14 从 C .rastonii 首次分离出两个具有溶血活性的蛋白 C rTX-A (43 kDa)和 Cr TX-B (46 kDa)以来, 世界各地的科学家从不同水母中提取多种不同的溶血毒素,并对部分毒素进行了测序 ,检测溶血活性已经成为粗毒活性检测的一项通用方法。值得一提的是, 同一水母的不同部位可能存在不同的溶血毒素 ,而同一溶血毒素也可能存在于不同水母毒素中, 其分布与活性具有交叉性。对于溶血毒素的作用机制 ,先前一般认为是由于水母刺丝囊毒液中含有磷脂酶、皂素等溶血素直接作用引起的 , Ishikaw a等 15 研究 C .quinquecirrha 刺丝囊毒液对兔红细胞的溶解活性时, 检测到呈剂量依赖性的 C5b -9 补体复合物, 表明溶血毒素可能是通过补体的激活, 在红细胞膜上形成 C5b -9 补体复合物而产生溶血效应的。具体的作用机制有待于进一步研究证实。2 .2神经毒性 水母毒素对神经系统的作用既有中枢活性,也有外周活性。对于外周神经系统 ,水母毒素可以使细胞膜去极化, 降低外周神经细胞的动作电位 ,阻断神经传导 ;对于中枢神经系统 ,具体作用机制还不明确 ,水母蜇伤后的神经症状表明水母神经毒素主要作用于中枢,呈现出明显的精神症状和体征 ,并可以最终导致死亡。Ishikaw a 等 15 将去除背侧颅骨的鱼 A .xenica 置于含有 C .quinquecir-rha 刺丝囊粗毒的林格液中 , 鱼出现旋转 、垂直或水平运动等平衡失调表现, 并于 48 h 之内全部死亡, 而对照组都存活 48 h 以上, 长者可达两周以上 ,表明水母毒素可以作用于中枢神经系统并产生致死效应。Sanchez-Rodriguez 等 5 从 C .arsupialis 刺丝囊中成功分离到分子量 120 kDa 的神经毒素(CmNt),将 0 .1 mL 0 .5 mg mL -1 的刺丝囊粗毒注入蟹的第三条腿, 迅速出现无意识的强烈收缩、痉挛和颤抖, 3 min 内死亡 , LD50 为 1 .05 g g -1 ;相比之下 , 注入纯的神经毒素者死亡时间延长到 30 min ,其 LD50 值增加至 15 g/g 。这可能是因为毒素不稳定,在分离过程中由于温度 、pH 等因素的变化而活性降低 ,更大可能的原因是水母毒素的毒性是多种成分共同作用的结果, 神经毒素只是其中之一 ,并非快速毒性反应的主要成分 ,也不是毒素致死的主要因素 ,快速毒性作用和毒素致死的主要成分可能是粗毒其他成分如心脏毒素等引起的, 由此可以解释纯神经毒素的毒性反而不如粗毒的毒性大。2 .3皮肤与肌肉毒性 C.rastonii 蜇伤后出现剧痛 , 红斑和水疱,瘙痒以及色素沉着等 ,研究证实病变主要为过敏性接触性皮炎, 多次蜇伤者的淋巴细胞反应比从未蜇伤者更为严重 16 。R .no-mad ica 蜇伤后迅速出现红斑, 灼烧感, 丘疹样水疱, 甚至出现严重的迟发性皮肤反应 17 。多数蜇伤者仅出现以疼痛为主要表现的皮肤症状, Nomura 等 18 用热水浴(40 41 )、木瓜蛋白酶和乙酸处理 C .alata 急性蜇伤的皮肤 ,发现热水浴缓解疼痛最为有效。Boulw are 19 模拟小丑鱼黏液样外衣 ,研制成一种称为 Safe Sea 的局部水母蜇伤防护剂,防护水母蜇伤有效率达 85 %。研制新型的皮肤防护剂对于水母蜇伤的预防是一条十分有效的途径。 水母毒素可引起平滑肌、骨骼肌和心肌的持续性收缩。P .physalis 毒素诱发豚鼠回肠收缩 ,用六甲胺 ,阿托品或羟甲基麦角酰胺治疗无效。高浓度 P .physalis 毒素注入蛙坐骨神经-腓肠肌标本 ,引起不可逆性肌肉强直性收缩,一旦收缩便对任何刺激无反应,但甘油处理过的无肌纤维膜的肌肉则不产生收缩反应。C .capillata 毒素除引起平滑肌收缩外,还可使心肌收缩 ,可能是由于细胞钙积聚引起的。此外 ,P .physalis 毒素还可以促进前列腺素分泌而使骨骼肌血管舒张,并可诱发肥大细胞脱颗粒和组织细胞溶解而释放组胺引起血管舒张 20 。2 .4酶活性 水母毒液中分离出多种酶类, 从 R .ma-nomad ica 毒液中分离出具有 -糜蛋白水解酶活性和磷脂酶活性的组分, S .melagris 毒液具有多种酶催化活性, 已鉴定出的酶类有5-核苷酸酶、透明质酸酶、酸性及碱性磷酸酶、磷酸二酯酶、亮氨酸氨肽酶等。 Li 等 21 发现 R .esculentum 毒液的酶活性依赖于温度和 pH 值 ,在 37 和 pH 8 .0时具有最大活性;磷酸盐缓冲液 (0 .02 M , pH 8 .0)中加入 Zn2 + ,M g2 + 和 M n2 + 等导致酶活性增加, 其中 M n2 +增加酶活性的幅度是 Mg2 +和 Zn2 + 的 20 倍 ;EDTA 可以增加酶的活性, 而 PM SF(苯甲基磺酰氟)对蛋白酶的活性没有影响 ;邻二氮杂菲和甘油抑制蛋白酶的活性 , 其抑制率分别达到 87 .5%和 82 .1%。由于方法学的限制, 先前一般认为 C.f leckeri 毒素不含有磷脂酶 ,其高效价溶血活性难以解释, Nevalainen 等 22 采用新的提取方法在 C.f leckeri 触手提取物中测到了高水平的PLA2 活性, 而在毒性较低的加勒比海水母C.rastonii 和C .barnesi 中测定的 PLA2 活性较低,结合先前研究 , 推测 PLA2 (磷脂酶A2)可能参与蜇伤部位的疼痛与部分系统症状如溶血等。2 .5抗氧化活性 活性氧(ROS)包括超氧阴离子(O2- )、羟自由基(OH)、过氧化氢(H 2 O2)、单线态氧(1O2 )以及一氧化氮(NO )等 , 是衰老、细胞损伤、DNA 和蛋白质降解等一系列事件发生的重要原因 ,也是许多慢性疾病的进展因素。ROS 中首先产生 O , 降解可以形成1 O2 和 OH ,并通过产生 H 2 O2 导致脂质过氧化。 OH 是目前所知的活性最强的物质之一,在体内可以对 DNA , 蛋白质 ,PUFA(多不饱和脂肪酸)几乎所有的生物大分子产生广泛的破坏作用。传统的人工合成的抗氧化剂如 BTH(丁羟甲苯)、BH A(丁羟茴醚)、PG(棓酸丙酯)、TBHQ(特丁基对苯二酚)等往往存在副作用 ,如 BT H , BH A 可能与肝细胞损伤及肝癌的发生有关。新型天然抗氧化剂主要来自于植物如种子、蔬菜、水果等, 而动物蛋白抗氧化剂鲜有报道。Yu 等 23 , 24 研究了 R .esculentum 触手和口周毒液的抗氧化及清除 ROS 活性 :所有分离到的组分都具有抗氧化和清除 ROS 能力 , 比维生素 C 和甘露醇以及 BH A , BH T 能力更强 , 清除倍,BH A 的 35 倍 ! 因其来源广泛, 无污染、副作用小 ,因而在药物开发中具有广阔的应用前景。3.结语水母毒素除了上述介绍的生物学活性外, 还有肝脏毒性 , 细胞毒性、杀虫毒性等,但这些活性的发挥有赖于水母毒素各组分的综合作用。由于毒素提取方法的不足和水母毒素本身的特性, 使得水母毒素的成分和相关活性研究都受到一定的限制, 新的能提取更纯且有生物活性的水母毒素的方法有待于进一步探索。水母毒素成分与生物活性的研究对开发水母中毒的防治药物以及新型的海洋药物都具有重要意义。参考文献 :1 Bloom DA , Burnett JW , Alderslade P.Partial purifi-cation of Box Jellyfish (Chir onex f leckeri)nematocyst ven-om isolated at the b eachside J .Tox icon , 1998 , 36(8):1075 .2Othman I, Burnett JW .T ech niques applicab le forpurifying Chironex f leckeri (box jellyfish) venom J . 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