分子生物学实验方案初稿.doc

室内培养蚤状溞的简易方法1. 所用试剂 磷酸氢二钾，磷酸二氢钾2. 装置与材料70100 L 的水族箱2个， 40 W 的日光型水族灯或日光灯1 个，金鱼充气泵1 个，水族箱恒温加热器1个，每平方厘米100140 目的小水网1个（自制或到水族商店购买）；馒头或动物肝脏，绿藻液数升。3. 培养方法水族箱( 50100 L) 置于靠北室内，防止阳光直射，以免水温昼夜变化过大。注满自来水，箱上方安装水族灯或日光灯，接上充气泵，通电。每个水簇箱投入磷酸氢二钾1020 g（视自来水的pH 值而定，如果自来水的pH 值低于7，用磷酸氢二钾调节水的pH值，如果自来水pH值是7，用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾共同调节水的pH 值）调节水的pH 值至77. 5，移入单细胞绿藻液（废弃的草履虫培养液近窗静置一段时间，待水色变绿时即可）。24 h照明和充气，至710 d，待水色呈淡绿色时，把蛋黄大小的馒头弄成十几小块撒入水中，或投入34 片鸡肝或一小片猪肝，次日移入蚤状溞，停止充气。水温1620 ，冬天，把加热器定温在1416 ，夏天把水簇箱置于阴凉处（水温28 以上不利于水蚤生长）。2 周左右水中会出现许多水蚤。用小水网捞取一些大小蚤喂水螅后，再投入一些碎馒头。以后水蚤多时，可以每天捞取一些水蚤喂水螅。水蚤少时，隔日捞取一些水蚤喂水螅。每周投入一些碎馒头。另一个水簇箱注满水，加入磷酸氢二钾和绿藻液，一直照明和通电，每隔10 d添加一些有机肥料，直到水色很绿时为止，待前一个水簇箱中水体变质时再移入少量水蚤，并投入一些馒头即可。4. 常年培养过程中的动态调节4. 1馒头或肝脏的投放时间依据水色和水中条件而定；水色较清，看不到馒头碎块，且水蚤密度较高，应及时投放适量馒头块或肝脏；如果水中有明显的馒头块或水质较浑浊，不需投放馒头或肝脏。如果水质已经很浑浊，水蚤都在近水面下游泳，应用网孔大一点的网捞取多余的馒头。4. 2光照时间 照明用日光型灯管，不可用紫外灯，紫外光有杀菌作用，不利于水蚤生长。开始时昼夜照明，待水色变绿后，白天照明夜晚关灯。如果水色变淡了，继续进行昼夜照明。不可用阳光直射，夏天置于阴凉通风处，或置于地下室，水温控制在25 以下。4. 3充气时间 水蚤一般喜静水，不可长时间充气，1次充气不要超过1 h，一般情况不需充气。如果气压较低，水蚤浮于水面或水质太清，或刚投入馒头屑，可以充气，以增加溶解氧或起搅拌作用。如果使用老化的气泵，出气量只是新气泵的一半左右，可以长期充气。4. 4其他动物饲养过程中可以投入一些涡虫，水底放置13 个瓦片或石片，便于涡虫藏身。水底会出现一些红色的摇蚊幼虫。摇蚊幼虫和涡虫可以清除水底的死蚤。摇蚊幼虫过多时，可以捞取大部分，洗干净后进行速冻保存，待水螅断粮时使用或用来喂鱼。4. 5施肥15 d左右投放5 g 磷酸氢二钾，并补充因蒸发而减少的水分。4. 6换水34个月左右或水蚤数量明显下降时，捞取水蚤暂时保种饲养数日，待彻底换水、施肥和加绿藻（方法同前）后，把水蚤移入水簇箱。4. 7水蚤密度水蚤的生命周期只有1周左右，繁殖速度很快，应随时控制其密度。如果水蚤成堆地密集在水面，水体中下层也有许多水蚤，应立即捞除水面的水蚤，可用无水乙醇冷冻保存。这些水蚤在24 h内经产卵后死亡，死水蚤如果没有被摇蚊幼虫和螺类吃完，会很快腐烂分解， 耗尽水体溶解氧，使水体中的所有动物窒息死亡，水体完全被破坏。在这种情况下只有重新开始培养。实验一 动物基因组DNA提取（以水蚤为材料）实验目的:了解并掌握提取动物基因组DNA的原理和步骤，以及相对分子量质量较大的DNA的琼脂糖凝胶电泳检测技术。实验原理:在EDTA和SDS等去污剂存在的条件下，用蛋白酶 K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到动物基因组DNA。实验仪器: 电泳仪，电泳槽，紫外分光光度计，凝胶成像系统，台式高速冷冻离心机，紫外分析仪。实验试剂:无水乙醇，SDS，蛋白酶K，Tris-HCl，EDTA，Tris碱，NaCl，氯仿，异戊醇，琼脂糖，溴化乙啶（10 mg/mL，具致癌作用，用时小心），硼酸，-Hind III，点样缓冲液Loading buffer（10，含0.25%溴酚蓝，40%甘油）。实验步骤:1. 取出酒精固定液中保存的样品或新鲜样品，室温中蒸发酒精，新鲜样品用蒸馏水清洗，去除动物表面水分。单个个体（或13只）置于1.5 mL微管中，用干净、消毒过的微针挑破动物几丁质外皮。依次加入 500 L TNE 抽提缓冲液（0.1 mol/L Tris 碱，10 mmol/L EDTA，2.0 mol/L NaCl，pH 8.0），Tris-HCl 50 L （pH 8.0,1M），5SDS 溶液 25 L（25，v/v），蛋白酶 K 20L（20mg/ml）。混合均匀后，置于 50 环境中消化 4-5 h，或37 过夜。2. DNA提取和纯化采取常规的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）提纯，异丙醇沉淀。（加入等体积的酚: 氯仿: 异戊醇混合溶液，混匀。11000 r / min 离心6min，吸取上清。加入等体积异丙醇，1/ 10 体积NaAC，混匀。- 80 1h（-20代替，沉淀1 h或更久）。12000 r / min 离心20 min，倒出上清液。加入70 %乙醇500 L，12000 r /min 离心10 min，小心倒出上清液，晾干）。提纯的DNA 基因组溶解于 50 L TE 缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；0.5-1.0 mmol/L EDTA, pH 8.0）中，并保存于 4环境。取出5 L 进行琼脂糖凝胶（0. 8 %）电泳。3. 紫外分光光度计检测。采用本方法提纯的DNA基因组样品纯度一般在1.6-1.8之间（OD260/OD280）。4.琼脂糖凝胶（agarose gel）电泳检测。制备 0.8琼脂糖凝胶；每加样孔加入DNA样品5L，加缓冲液（0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，15 Ficoll 水溶液）3 L。DNA分子量指示剂为-Hind III。电泳缓冲液 1 TBE 缓冲液（5 TBE 储存液（1L）：54g Tris 碱，27.5 g 硼酸，20 mL 0.5 mol/L EDTA, pH 8.0），电场强度 9V/cm。溴化乙啶溶液（EB溶液，0.5 g/mL）染色20-30 min。5. 在凝胶成像系统下采用紫外线（波长 302 nm）显示 DNA 提取情况，并拍照。6. 其它DNA样品可直接进行下一步操作或-20 保存备用。实验二 目的基因片段（mtDNA COI）的扩增实验目的:1. 学习PCR反应的基本原理和实验技术。2. 了解引物设计的一般要求。实验原理:多聚酶链式反应（polymerase chain reaction），简称PCR技术，是近年来发展起来的一种体外DNA片段扩增技术。PCR技术实际上是在模板DNA、引物（primer）和4种DNA单体存在的条件下依赖于DNA聚合酶的一种酶促反应。反应主要有三个过程：1变性（denature），通过加热使DNA双螺旋的H键断裂，双链解离形成单链，以便引物识别起始位置；2退火（annealing），突然降低温度，引物识别模板DNA 上与其互补的位置并形成杂交链；3延伸（extension），在DNA聚合酶和4种DNA单体以及Mg2+存在的条件下，53的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。这3个反应过程周而复始，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到大量复制，数量可达 106-7拷贝。PCR技术操作简便，极为简化了传统的分子克隆技术。为此得到普遍的应用。实验仪器: 电泳仪，电泳槽，凝胶成像系统，台式高速冷冻离心机，紫外分析仪。实验试剂:Taq DNA聚合酶，10反应缓冲液， MgCl2，dNTP，引物（P1、P2），溴化乙啶（EB，10 mg/mL，具致癌作用，用时小心），点样缓冲液Loading buffer（10，含0.25%溴酚蓝，40%甘油）。实验步骤:1. 引物的设计与合成 Folmer et al（.1994）提出根据已发表的序列所设计的 consensus primers 可扩增出一个约700bp范围的线粒体COI基因片段，该COI引物 是 以Drosophila yakuba序 列 的 位 置 数 目 命 名 的 （ Clary &Wolstenholme，1995）。引物序列如下：LCO-1490：5-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3HCO-2198：5-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-32. PCR反应体系：总体积为 25 L，具体如下：10 Buffer： 2.5 LMg2： 1.0 LLCO-1490： 0.5 LHCO-2198： 0.5 LdNTP： 0.25 LTaq： 0.15 LDNA Template： 2.0 LH2O： 18.1 L 25 L 3. PCR扩增程序 以 Hill et al. (2001) 提出的程序为基础，根据实际情况进行修改，其中退火这一步骤在不同的批次样品之间差别较大，一般选择42 。实验证明，这一步骤可控制在42 4 范围内，都能扩增出目的基因片段。热循环具体程序如下：pre-denature: 94 5mindenature 94 1minannealing 42 2minextension 72 3mincycling from denature to extension for 40 timesfinal extension 72 10min实验三 PCR产物用琼脂糖凝胶电泳方法检测实验目的:学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度、含量以及分子量的大小。实验原理:水平式琼脂糖凝胶电泳是分子生物学操作中最常规的实验方法，它简单易行，只需少量的DNA就能检测，其分辨效果比分光光度计法与溴化乙啶-标准浓度DNA比较法更高，更直接，检测DNA范围更广，其原理是溴化乙啶在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物；使得DNA发射的荧光，增强几十倍。而荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品做琼脂糖凝胶电泳的对照，就可比较出待测样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶直接在紫外光下照射拍照，只需510 ng DNA，就可以从照片上比较鉴别。如肉眼观察，可检测到0.010.1 ng的DNA。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷的多少而定，后者则主要与分子大小及构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷。在电场中向着正极移动，在用电泳法检测DNA分子时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使得分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度差异所决定，提高分辨率。同时适当降低电泳时的电压，也可以使分子筛效应相应增强而提高分辨率。实验仪器: PCR扩增仪，台式离心机，紫外分析仪，恒温水浴锅，凝胶成像系统。实验试剂:琼脂糖，溴化乙啶（EB：10 mg/mL，具致癌作用，用时小心），点样缓冲液Loading buffer（10，含0.25%溴酚蓝，40%甘油）。实验步骤:1. 选择合适的水平式电泳仪，调节电泳槽平面至水平，检测稳压电源与正负极的线路。2. 选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在电泳槽负极的一端，使得点样梳的底部与电泳槽水平面的距离为0.51.0 mm。3. 制备琼脂糖凝胶：按照被分离的DNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。一般情况下可参考下表：琼脂糖的含量（%）g/ml分离线状DNA分子的有限范围（kb）0.36050.62010.7100.80.970.51.260.41.540.22.030.1称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，一般配制约40 ml 凝胶液，置微波炉中或水浴加热，至琼脂糖融化均匀。4. 将凝胶槽洗净擦干，两端用胶布封好，在一端插好梳子。待凝胶溶液冷却至60 左右时，在凝胶溶液