CSPPT-叶酸对成人高血压患者预防脑卒中的疗效.doc

叶酸对成人高血压患者预防脑卒中的疗效试验意义：由于数据的限制性，叶酸对脑卒中一级预防的效果仍有不确定因素的存在。试验目的：验证-依那普利与叶酸联合治疗比单独使用依那普利能更有效降低中国成人高血压患者初发脑卒中的风险。实验设计及样本人群：中国脑卒中一级预防实验，从2008年5月19日开始至2013年8月24日结束，历时5年3个月，遵循随机、双盲原则，其涉及江苏、安徽两省内32个社区，参与者共有20702位（均有高血压病史，但无中风和心肌梗死病史）。试验设计：符合纳入条件的参与者通过MTHFR C677T 基因型筛选后，随机分为依那普利10mg+叶酸0.8mg组合片联合治疗组（10348人），依那普利10mg片剂单独治疗组（10354人）。试验主要计量转归事件：主要转归为“初发中风”，次要转归为“初发缺血性脑卒中”、“初发出血性脑卒中”、“心肌梗死”、“复合心血管事件（包括心血管死亡、心肌梗死、脑卒中）”及“全因死亡”。试验结果：4年半的持续性治疗显示：与依那普利单独组相比，依那普利和叶酸联合治疗组显著降低了“初发脑卒中”（2.7联合组VS3.4单独组; HR，0.79; 95CI，0.68-0.93）、“初发缺血性中风”（2.2联合组VS 2.8单独组; HR，0.76; 95CI，0.64-0.91）和“复合心血管事件”（3.1联合组VS 3.9单独组; HR，0.80; 95CI，0.69-0.92）的发生风险。但两组间“初发出血性脑卒中”（HR，0.93; 95CI，0.65-1.34）、“心肌梗死”（HR，1.04; 95CI，0.60-1.82）以及“全因死亡”（HR，0.94; 95CI，0.81- 1.10）的发生风险无明显差异。同时，不良事件的频率在2个治疗组之间也没有显著差异。）试验结论：在无脑卒中和心肌梗死病史的成人高血压患者中，与单独使用依那普利相比，依那普利+叶酸联合治疗更能有效的降低脑卒中初发的风险。这些研究结果与高血压或低基线叶酸水平的成年人使用叶酸的好处是一致的。调查研究脑卒中目前高居中国国民死亡原因的第一位，同时是全球第二大死因。一级预防对于77%的脑卒中患者来说是首要事件，2但由于数据的不完善及调查的限制性，叶酸在脑卒中一级预防中的具体作用仍然有不明确的部分。尽管一些临床试验研究及META分析明确表明叶酸能够降低脑卒中的风险，6、8、13但是大多数的相关的二级预防随机试验并没有验证叶酸补充剂有有效预防心血管疾病的作用4-12这就提出了一个可能性，即叶酸对脑卒中的预防作用比心血管疾病更有效，但是前期的所有试验没有一个研究涉及叶酸对初发脑卒中转归的意义。而且，一个随机试验的META分析还证明过叶酸在降低脑卒中发生风险方面存在天花板效应（约0.8mg/d）。14此外，大多数相关的临床试验都是在高叶酸摄入的地区进行的，因为存在天花板效应，所以这些试验也许不能很有效的验明叶酸的积极效益。四氢叶酸还原酶是调节叶酸代谢的最主要的酶。四氢叶酸还原酶基因C677T的多态性导致酶活性降低，从而导致了叶酸水平的降低。大量遗传研究和临床试验的META分析显示MTHFR C677T基因变异对卒中风险的影响可能被体内叶酸状态而变化。综上所诉，叶酸在脑卒中一级/二级预防中的功效受个人因素、叶酸基线水平、C677T基因多样性的影响。中国脑卒中初发试验表明：对于成人高血压患者，依那普利+叶酸联合治疗比单独使用依那普利能更有效降低脑卒中初发风险。方法研究监督本研究经中国合肥安徽医科大学生物医学研究所伦理委员会批准（(FWA assurance number FWA00001263）。所有参与者均已签署知情同意书。实验方案和数据分析规划详见补充1。此试验设计在学术指导委员会和执行委员会的监督下完成。所有的转归事件，包括主要转归和次要转归，都有其独立的断点审判，而且审判者均不知道自己所裁定的研究组。一个独立的数据和安全监测委员会(DSMB)临时性的对数据分析的安全性和有效性进行监督。试验完成后，数据库立即锁定，在写作组整理出首稿之后所有作者再相继修订。参与者纳入的参与者为45-75岁之间的高血压患者（收缩压140mmHg或舒张压90mmHg）或正在进行抗高血压药物治疗的患者者，无性别限制。主要的排除标准包括已诊断有脑卒中、心肌梗死（MI）、心脏衰竭、冠状动脉血运重建或先天性心脏病病史者（详见补充1）。试验设计CSPPT是一个多社区、随机、双盲的临床研究试验，其从2008年5月19日始至2013年8月24日止，涉及江苏，安徽两省32个社区，并在每省设置一个研究协调中心。该试验由3个阶段组成，即：1、筛选和招募；2、3周的磨合治疗期；3、5年的随机治疗期。筛选和招聘在筛选阶段，每个参与者均要进行体检并完成一份关于生活方式、疾病史和服药史的问卷调查。MTHFR C677T基因多态性的分型也在此阶段完成。磨合治疗期通过上述纳入和排除标准，甄选出所有符合条件的参与者，并要求口服3周依那普利（10mg/日）。依从性良好、对依那普利无过敏反应者均纳入下一阶段。随机化治疗期进入此阶段的参与者通过MTHFRC677T的基因型（CC，CT，或TT）进行分层，并以1：1的比例随机分配到两组：1、含10mg依那普利和0.8毫克叶酸的单片药剂（依那普利-叶酸联合治疗组）；2、仅含10mg依那普利的单片药剂（依那普利组）（图1）。这两种类型的片剂由同一胶囊包装，其外观、大小、颜色、口味均相同。随机化是由4组随机表方法集中执行：1是一个随机的药品编码和处理分配，其它3个是MTHFR C677T基因型（CC，CT，或TT）特定的随机序列并规定区间大小为4。所有研究者和参与者均不知道随机化处理和任务分配明细。试验期间，可同时使用的其它抗高血压药（主要是钙通道阻滞剂或利尿剂），但不能使用B族维生素。随访每3个月随访一次。每次随访由训练有素的科研人员和医生完成，内容包括：生命体征、研究药物依从性、合并用药、不良事件以及可能的终点事件的记录。实验室检测MTHFR C677T（rs1801133）的多态性通过ABI Prism 7900HT序列检测系统使用TaqMan探针法进行检测（Life Technologies），且重复实验的一致率为99.4。在实验室使用免疫荧光测定法（新工业）测量血清叶酸和维生素B12的基线水平及退出随访水平。使用自动临床分析仪（Beckman Coulter公司）测量血清同型半胱氨酸、空腹血脂和血糖的基线水平及退出随访水平。该数据在广州南方医院国家临床肾病研究中心的核心实验室内测量完成。结果评价关于定义和事件裁决的更多详细信息可参见补充1，简单地说，主要转归是初发的非致死性或致死性卒中（缺血性或出血），不包括蛛网膜下腔出血和无症状卒中。所有疑似卒中的病例包括医疗记录、影像数据以及事件报表的原始数据均提交给审判委员会做进一步查证。次要转归包括复合心血管事件（心血管死亡，心肌梗死和卒中）、初发性缺血性脑卒中（致死性和非致死性）、初发性出血性中风（致死性和非致死性）、MI和全因死亡。心肌梗死需要满足以下条件之一：1、缺血症状；2、心肌损伤相对应的心电图改变。心血管死亡包括心脏猝死（心肌梗塞；心脏衰竭；脑卒中；心血管或侵入性操作）、心脑血管出血性疾病和其他已知的血管疾病性原因。全因死亡包括所有致死性原因。死亡的确立必须有由医院或调查员家访所得的死亡证明。安全转归包括所有报告的不良事件、任何药物相关的不良事件、任何严重不良事件、不良事件导致停药和有临床意义的异常的实验室检查结果。在探索分析中，我们进一步研究基线血清叶酸水平的修正效应（以四分位数）和MTHFR C677T基因型与叶酸两者之间对主要转归的治疗效果的相互作用。统计分析基于大量的流行病学研究，年龄在45岁75岁之间的中国成人高血压患者脑卒中的年发病率约为1.0。16因为考虑到进入试验的参与者会有更好的血压管理，所以我们假设依那普利组脑卒中的年发病率为0.7。我们从前期8个随机试验的META分析中评估出服用叶酸补充剂的患者其脑卒中的风险比（HR）约为0.82。某些区域不食用叶酸强化谷物，在这些区域的亚组中脑卒中的风险比约为0.75，我们的CSPPT参与者则就来自这些区域。但是为了保守起见，我们假设5年随访中的风险比为0.80 （5%的I型错误率）；因此，试验将需要20 337的样本量。所以在这项试验中20 702的样本量足够充分解决首要研究的试验假设。临时有效性分析仅集中在主要转归，而the OBrien-Fleming alpha支出函数用于定义统计显着性的边界。17只有DSMB（数据安全监督委员）成员可访问中期分析的结果。在出现下列情况之一时DSMB可能会建议终止试验：1、2个治疗组之间存在显著的疗效差异;2、依那普利-叶酸组存在更大的风险收益比;3、在合理的时间段内，试验成功的可能性很低（如，患者低治疗依从性、转归事件低发病率）。意向性治疗原则组（ITT）包括随机接受治疗的所有参与者，其用于主要疗效分析。符合方案集分析组由与协议无重大偏差并且在试验结束后整体治疗依从率70的所有参与者组成，且主要用于主要转归的的敏感性分析。安全组由ITT组的参与者组成，除未服用任何研究药物或没有随访记录的人员外。 如果某次服用药片片数的数据缺失，但最后访问的数据是可用，那么丢失的数据则通过最后的总结向前推测进行填补；否则，输入的数字是0。对于其他所有变量，丢失的数据被视为失去其有效性和安全性分析的价值。因为缺失数据相较较少，我们并不希望缺失的数据会显著影响主要转归的试验结果。为了检验主要假设，主要转归的疗效分析将遵循ITT原则。转归事件的效能指数为从随机化分组到出现感兴趣的首次事件的时间。依那普利-叶酸联合治疗组和依那普利单独治疗组的累计发生率分别采用Kaplan-Meier法进行估算。原始和调整后的的HR及95的置信区间由Cox比例风险回归模型进行估计。考虑到前面主要转归的中期疗效分析结果（见补充1统计分析计划），最后的分析中使用未经调整的双尾P0.048作为主要转归疗效分析的有意义的截止点。同时，主要转归还进行了两项敏感性分析。第一个敏感性分析是评估符合方案集的风险值。第二敏感性分析涉及复合转归（其包括主要成果和全因死亡）。这一分析的主要目的是为了处理两个治疗组之间的其他死亡原因所带来潜存的差异竞争风险（differential competing risks）。一种类似的方法同时也应用于所有次要转归的疗效分析，但它们以未经调整的双尾P0.05作为标准。在探索性分析中，我们首先考察了血清叶酸水平的修饰效果（以四分位数）和MTHFRC677T基因型对叶酸治疗疗效的相互作用。还有亚组分析的其他变量，包括性别、基线年龄、血清同型半胱氨酸水平（以四分位数）、血清维生素B12的水平（以四分位数）和吸烟。以上所有数据的统计分析软件为2.15.1版R软件 （http:/www.R-/）结果研究参与者和基线特征如在图1所示， 2008年5月和2009年8月期间从29 190人中筛选出 20 702名合格者， 其平均年龄为60.0岁（SD，7.5岁），并随机分配到依那普利-叶酸联合治疗组（10 348人）和依那普利单独治疗组（10354人）。因为两个治疗组均使用降脂药（0.8）、降糖药（1.6）和抗血小板药物（3.1），所以志愿者自报高脂血症和糖尿病的比例低，分别为2.7和3.1至3.2。同时，维生素B12缺乏（0.05）。治疗随访多数受试者（依那普利-叶酸组69.1n = 7152、依那普利组69.2N = 7159）服用了至少70的研究药物而没有重大违反方案的行为。研究停药率分别为依那普利-叶酸组14.2、依那普利组14.1。两组中中途停止干预的受试者大多数仍然持续随访至终点事件。但是在试验完成之前仍分别有32（0.3依那普利-叶酸组）和35（0.3依那普利组）名受试者失去随访。失去随访的所有受试者都将包括在最后的分析中，并在最后随访的时间进行审查。血清叶酸水平对叶酸治疗的影响大多数受试者会分别在试验开始和随访结束时进行血清叶酸水平的测定即基线水平和退出水平。试验人员对两个治疗组的不同基因型之间的基线叶酸水平进行比较。治疗后，依那普利-叶酸组叶酸值的中位数增加了11.2ng/mL、依那普利组增加了4.4ng/mL，并且治疗后各MTHFRC677T基因型之间叶酸增长的平均中值没有显著性差异。（表2和在e图 1补充 2）。表2.治疗前后总样本和各基因型间的血清叶酸水平及血压情况基线血压和治疗期间血压2组之间的平均收缩压和舒张压的基线水平和退出水平具有高度可比性（表2和e图 2补充 2）。在试验期间，依那普利-叶酸组和依那普利组的平均血压水平分别为139.7 /83.0mmHg和139.8 /83.1mmHg，其血压值会在各基因型间进行比较。同时，57.1的受试者伴随服用其他降压药，其中41.2的人服用1种额外的药物、15.9的人服用2种额外的药物。他们服用的伴随抗高血压药物的种类主要是钙通道阻滞剂（依那普利-叶酸组48.8、依那普利组48.9）和利尿剂（依那普利-叶酸组2 4.0和依那普利组24.2）。在主、次转归方面叶酸治疗的功效分析在2013年6月，48个月的治疗和590主要终点事件之后，DSMB进行的第四次中期分析观察到两个治疗组间的显著性疗效差异（P = 0.003，数秩检验）。超过了预先规定的停止边界。因此，DSMB建议提前终止试验。在分析DSMB的建议之后，督导委员会终止了试验，并在3个月内对所有受试者进行了最后一次访问。在意向性治疗原则分析中，2个治疗组初发脑卒中累计事件发生率如图2 Kaplan-Meier曲线所示。在4.5年（四分位距，4.2-4.7岁）治疗时间内，依那普利-叶酸组与依那普利组相比初发脑卒中人数分别为282（2.7）和355（3.4）人，即叶酸组绝对减少了0.7的风险和相对降低21的风险（HR，0.79 95CI，0.68-0.93;P= 0.003;需要治疗的人数4.5年 = 141 95CI，85-426）（表3）。同样，复合转归（由主要转归和全因死亡构成）的分析得到了一致的结果（5.4依那普利-叶酸组与6.2依那普利组; HR，0.86; 95CI，0.77-0.97;P= 0.01）。采用符合方案集分析主要转归（事件发生数量/受试者人数：152/7159依那普利-叶酸组、199/7152依那普利组）也产生相似的效果（HR，0.76; 95CI，0.62-0.94;P= 0.01）。基于计算机断层扫描（N = 577）或磁共振成像技术（N = 168），卒中病例被进一步分为缺血性或出血性脑卒中。在110名同时使用计算机断层扫描与核磁共振成像的受试者，卒中结果的符合率为100。如果图像数据无法获得（N = 2），卒中将通过临床症状进行定义。次要转归的分析显示，依那普利-叶酸组受试者缺血性卒中（2.2依那普利-叶酸组与2.8依那普利组; HR，0.76; 95CI，0.64- 0.91;P= 0.002）和复合心血管事件（3.1依那普利-叶酸组与3.9依那普利组; HR，0.80; 95CI，0.69-0.92;P= 0.002）的风险显著减少（表3和e图3补充 2）。但是，两组之间出血性脑卒中（0.60VS0.56; HR，0.93; 95CI，0.65-1.34;P= 0.71） 、MI（0.24VS0.23; HR，1.04; 95CI，0.60-1.82;P= 0.89）或全因死亡（2.9VS3.1; HR，0.94; 95CI，0.81-1.10;P= 0.47）三项次要转归无显著性差异（表3）。图2.两组初发脑卒中累积发生率的Kaplan-Meier曲线图3.主、次转归的风险比通过重要协变量进行分层分析通过MTHFRC677T的基因型（CC，CT和TT）、同型半胱氨酸的四分位数、叶酸、维生素B12、年龄（每10年一级别）、性别和吸烟情况对数据进行分成分析。在任何一个亚组均没有显著相互作用（P 0.05，所有的比较），包括叶酸水平（P= 0.16）和MTHFRC677T基因型（P= 0.16）;但是，具有较低叶酸基线水平者其有益效果更加明显（在eFigure 4补充2）。探索性分析叶酸基线水平和MTHFR C677T基因型E图 5补充2示，通过MTHFRC677T基因型和叶酸基线水平分别对依那普利-叶酸组与依那普利组初发脑卒中的发生率进行分层分析。在依那普利组， 大多数CC基因型（正常纯合子）受试者基线叶酸水平和脑卒中风险呈反比关系即基线叶酸水平越低，卒中风险越高（P= 0.01，线性趋势）。同样的，CT基因型（杂合子）受试者符合上述规律（P= 0.01为线性趋势）。所以如图示所见CC和CT基因型叶酸基线水平最低四分位数时其卒中风险值最大。但是TT型（纯合的变体）受试者在所有叶酸基线水平处均有持续性高风险（P= 0.65，线性趋势）。在每个基因型和基线叶酸分组中进一步评估叶酸治疗对初发脑卒中的疗效。在叶酸水平低于中位数基线叶酸水平时，大多数CC基因型受试者的叶酸治疗显著降低了脑卒中的风险（绝对风险减少比例，2.1; HR，0.45; 95CI，0.29-0.72;P= 0.001）。同样的试验方法观察到大多数CT基因型受试者于最低四分位数处有最大疗效（绝对减少风险，1.4; HR，0.68; 95CI，0.44-1.07;P= 0.10）。与此相反，大多数TT基因型受试者在基线叶酸水平最高四分位数处，体现出叶酸治疗对脑卒中的预防作用（绝对减少2.8; HR，0.24; 95CI，0.10-0.58;P= 0.001 ）。即，对于CC、CT基因型，当其处于最低基线叶酸水平时，脑卒中的风险最高、叶酸治疗的疗效最好；而TT基因型受试者在不同的基线叶酸值均有较高的卒中风险，且有相对较大的叶酸需求。不良事件2个治疗组之间的任何不良事件频率的报告没有显著的差异，（定义e表 3和4补充2）。.治疗组间的其他安全转归无统计学意义，包括严重不良事件、不良事件导致停药和实验室检查的异常结果。讨论叶酸补充剂在预防脑卒中方面的效果还不够完善。3 CSPPT，即在中国无脑卒中和心肌梗死病史的成人高血压人群间的大型随机试验发现：与单独用依那普利相比，依那普利-叶酸治疗显著减少了初发脑卒中相对风险（21）。进一步调整重要协变量，包括基线高半胱氨酸水平，结果基本同上（见表3）。Clarke等人18报道的一份荟萃分析显示：叶酸补充剂对降低脑卒中的风险没有显著性意义（N = 35603;RR率比，0.96; 95CI，0.87-1.06）。由霍等人14，完成的最新和最全面的荟萃分析，其包括Clarke等人荟萃分析所有的试验报告，发现补充叶酸显著降低了脑卒中的风险（15个随机试验; N = 55 764;相对危险度，0.92; 95CI，0.86-1.00;P= 0.04）;尤其是，没有叶酸强化的试验组（N =43 426;相对风险度，0.89; 95CI，0.82-0.97;P= 0.01）及他汀类药物使用率较低的试验组（相对风险度，0.77; 95CI，0.64-0.92;P= 0.005）。叶酸补充剂和脑卒中发生风险之间的变量的关联强度可能会因为试验设计和受试者的特征产生重要差异。在CSPPT之前，曾有一个对脑卒中一级预防特别缺乏有力证据的随机临床试验。已发表的四个的关于补充叶酸的试验（脑卒中事件超过200例）：SEARCH（534例; HR，1.02;95CI，0.86-1.21）4、VITATOPS（748例; HR，0.92; 95CI，0.81-1.06）5、HOPE-2（258例; HR，0.75;95CI，0.59-0.97）6、和VISP（300例; HR，1.04;95CI，0.84-1.29）7。4项试验均以有心血管疾病病史、无脑卒中病史的患者人群作为试验对象进行研究。CSPPT 20 702名参与者中卒中发生事件为637例，是迄今为止脑卒中一级预防试验中样本量最大的临床试验，发生脑卒中的事件例数（637例）仅次于VITATOPS5（748例，主要是卒中复发）。CSPPT通过对单个基准叶酸水平和MTHFR基因型的数据分析，发现了有力证据证明基线叶酸水平是叶酸预防脑卒中的重要决定因素。尽管前期随机试验的荟萃分析显示低叶酸水平时叶酸治疗对预防脑卒中有更大的有益效果13-15 。CSPPT是第一个使用个体基线叶酸水平来验证假设的大规模随机试验。在没有叶酸强化的人群中，我们观察到血浆叶酸水平有相当大的个体差异，并清楚地表明了有益的作用似乎在低叶酸水平的受试者中更加明显。相比较而言，VISP研究是在美国一叶酸强化区域进行的。7在北美强制性的叶酸强化已对人血浆叶酸水平产生显著的积极影响。19在VISP研究中基线叶酸水平的平均值约为28 nmol / L（12.4ng/mL），这较CSPPT试验高约50。因此，之所以前期在高叶酸水平区域的叶酸试验中常常产生空结果，这很可能是因为高叶酸区域叶酸补充的“天花板效应”。14MTHFR基因型对脑卒中的影响需要在基线叶酸水平的背景下进行评估，正如由霍姆斯等15完成的一个大型的遗传研究和临床试验的荟萃分析所指示： MTHFR基因对脑卒中风险的影响是随人口膳食叶酸水平（基于生态数据）的改变而改变的。他们推测，在低叶酸区域（亚洲）叶酸干预将会有一个较大的影响（相对危险度，0.78; 95CI，0.68-0.90）。据我们所知，CSPPT是第一个使用个体MTHFR基因型和基线叶酸水平来验证假设的大规模随机试验。这样的设计允许（1）在主要分析上通过分层随机MTHFRC677T基因型的方式来控制基因混杂因素（2）研究基线叶酸水平和MTHFR基因型这两个因素在叶酸治疗功效上的共同作用。从MTHFR基因型和基线叶酸水平的联合分析结果可以看出，对于CC或CT基因型的受试者，当其处于最低基线叶酸水平时，脑卒中的风险最高、叶酸治疗的疗效最好。此外，我们的数据表明，TT基因型受试者可能需要补充更高剂量的叶酸以克服生理水平的不足（反映在TT基因型受试者有相对 较大的叶酸需求）。CSPPT的另一个独特的方面