蛇苔生物素羧基载体蛋白序列分析.doc

绵阳师范学院2013届本科毕业论文 蛇苔生物素羧基载体蛋白的序列分析及功能预测 （2013）届本科生毕业设计（论文）题 目 蛇苔生物素羧基载体蛋白序列分析及 功能预测 专 业 生 物 技 术 院 部 生命科学与技术学院 学 号 姓 名 指 导 教 师 二 O 一 三 年 五 月论文题目来源： 国家自然科学基金项目编号： 四川省自然科学研究项目编号： 校级自然科学研究项目编号： 蛇苔BCCP的序列分析及功能预测学 生： 指导教师：摘 要：通过核酸序列比对, 在蛇苔cDNA文库中获得生物素羧基载体蛋白(BCCP）基因序列,并对其编码的蛋白质产物从同源性、氨基酸组成、理化性质、亚细胞位点、结构和功能等进行生物信息学分析和预测。结果表明, 该cDNA序列具有完整的开放阅读框( ORF, 88642 bp), 推测编码蛋白为184个氨基酸,它与拟南芥和云杉有较高的保守性（相似性分别为48%和50%）；蛇苔生物素载体蛋白的分子量为19391.4 Da，属于亲水性蛋白；通过比对预测在蛇苔生物素载体蛋白中，生物素结合的活性位点为Gly140，和羰基转移酶结合的功能位点为Gly130、 Lue139 、Gly140、Asp148。关键词：生物素羧基载体蛋白(BCCP)；蛇苔；生物信息学; 序列；预测工具Sequence Analysis and Function Predication of Biotin Carboxyl Carrier Protein From Conocephalum conicum (L. ) DumUndergraduate: Liu JingSupervisor: Bian Chun XiangAbstract: The use of the tools of bioinformatics allows us to analyse and predict the biotin carboxyl carrier protein whose nucleotide sequence is acquired from the cDNA library of Comocep-batum conicus(L.) Dun. constructed at the lab in the following aspects: the homology, composition of amino acids, physico-chemical charachers, subcellular location, tertiary structure, function,ect.The result indicates the biotin carboxyl carrier protein is a hydrophilic protein,which molecular weight is 19391.4 Da.In the biotin carboxyl carrier protein, the active site interacting with biotin structure is Gly140, and the active sites interacting with carbonyl transferase are Gly130、Lue139、Gly140.Key words:Biotin carboxyl carrier protein;Comocep-batum conicus(L.) Dun.; Bioinformatics; Sequence; Prediction tools目 录1前言11.1生物素羧基载体蛋白的功能11.2生物素羧基载体蛋白研究现状11.3材料与方法12结果分析32.1蛇苔生物素羧基载体蛋白的基因序列的获取与多序列比对分析32.2蛇苔生物素羧基载体蛋白的理化性质32.3蛇苔生物素羧基载体蛋白的氨基酸序列的亲水性/疏水性分析42.4蛇苔生物素羧基载体蛋白的亚细胞位点和N端信号肽分析42.5蛇苔生物素羧基载体蛋白的翻译后修饰和其三级结构预测42.6蛇苔生物素羧基载体蛋白的功能区预测43小结44讨论85不足之处9参考文献:11致 谢13 绵阳师范学院2013届本科毕业论文 1前言1.1生物素羧基载体蛋白的功能 生物素羧基载体蛋白（BCCP）是许多生物素依赖酶，它的功能是将二氧化碳从一个亚位点转移到另一个亚位点，发生羧化，脱羧，或转羧基反应。在细菌和动物体内反应的过程中，生物素载体蛋白与生物素结合位点的氨基酸多为赖氨酸（Lys），在植物中此结合位点多为甘氨酸(Gly）。 生物素羧基载体蛋白是构成乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的重要亚基2，乙酰辅酶A羧化酶是由生物素羧基载体蛋白、生物素羧化酶（BC）以及羧基转移酶（CT）的两个亚基-CT和-CT组成的多肽复合物。植物乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）又是植物脂肪酸合成的关键酶1，它的活性决定了脂肪酸的合成速度，因而成为植物种子含油量基因调控的关键靶标。乙酰辅酶A羧化酶催化作用分两步反应完成：首先是在BC结构域的催化和ATP 的参与下发生生物素羧化作用，使蛋白质结合的生物素辅基羧化，然后在CT结构域的催化下，将羧基从羧基生物素转移到乙酰辅酶A，形成丙二酰辅酶A。生物素羧基载体蛋白含有一个保守的生物素化基元，因此生物素羧基载体蛋白亚基涉及到BC和CT 的活性部位。生物素羧基载体蛋白作为乙酰辅酶A羧化酶的重要组成部分，是连接乙酰辅酶A羧化酶另外3个亚基的纽带和桥梁，在植物种子脂肪酸的合成过程中扮演着十分重要的作用。1.2 生物素羧基载体蛋白研究现状 Choi等(1995)首次从拟南芥(Arabidopsisthaliana)中克隆到了生物素羧基载体蛋白基因,Thelen等(2002b)构建了拟南芥BCCP2基因的反义表达载体与超表达载体并转化拟南芥。随后在大豆(Glycine max)、欧洲油菜(Brassica rtapus)、花生(Arachis hypogaea)、陆地棉(Gossypium hirsutum)和麻疯树(Jatropha clzrca)等多种植物中分离出此基因，并将陆地棉生物素羧基载体蛋白基因转化拟南芥，但是关于蛇苔生物素羧基载体蛋白的序列分析及功能预测方面的研究还未有文献报道。 四亿多年前, 苔类植物从单细胞水生藻类进化而来, 它是最早的陆生植物之一。苔类分布很广,能适应多种气候环境. 世界各处几乎都有分布,尤其多生于阴暗潮湿地区,如热带雨林和山林,特别是土坡、沟边或沼泽地等苔藓植物虽然分布面积较广,但密度较小且种间杂生,不易区别和分离,难以大量采集. 对其进行化学成分的研究长期受到忽视. 直到近30年来,随着分析仪器精密性越来越好,分析技术不断进步,测定一个天然产物的结构所需要的量越来越少,苔类植物化学成分的研究才取得一定进展. 研究结果表明,苔类植物含有参与基础代谢过程的基本化合物,包括无机物、碳水化合物、蛋白质、核酸、类脂化合物和有机酸. 此外还能分离出大量次级代谢产物. 苔类植物中具有许多新颖的结构骨架,含有不少生物活性成分,表明苔藓植物是具有潜力的天然产物的宝库 36 .2008年, Stefan等在Science上报道首个苔类植物的基因组序列, 从而为苔类植物作为一种模式生物来研究陆生植物的进化提供了有力的支持, 并引起了对苔类植物的研究热潮。本文是以蛇苔为材料来研究生物素羧基载体蛋白, 采用生物信息学的方法对其推导的氨基酸序列从组成、理化性质、亚细胞定位、翻译后修饰和结构功能等进行预测和分析, 进而为研究苔类植物生物素羧基载体蛋白的作用机制乃至整个电子传递途径奠定基础。1.3 材料与方法子沟自然保护区。总RNA的提取是参考改进过的LiCl方法; SMARTTMcDNA Library Construction试剂盒购自美国Clontech公司;DNA序列测定在上海Invitrogen公司完成。 依据DNAStar、ProtParam以及/Blast.cgi、http: /expasy. org/sprot /和http: /www.unipro.torg/等网站提供的生物信息学软件在线进行分析。核酸及氨基酸序列的同源性分析和多序列比对是用Blast和ClustaWl2完成; 用ORF Finder、ProtParam和ProtScale对开放阅读框、理化性质和亲水性、疏水性分别进行分析;亚细胞位点和N端信号肽分析是通过Wolf Psort Prediction和iPSORT软件完成;最后利用TermiNator和Geno3D在线软件对翻译后修饰、三级结构和功能进行预测分析。2 结果分析2.1 蛇苔生物素羧基载体蛋白的基因序列的获取与多序列比对分析 通过改进的LiCl方法获得了较高质量的RNA,保证该cDNA 文库构建的质量(图1) 图1 对蛇苔总RNA提取的琼脂糖凝胶分析用NCBI中的Specialized Blast对测序结果进行分析得到一条长974 bp的核酸序列, 它包括一个555 bp 的开放阅读框, 编码184个氨基酸(图2 )。以起始密码子ATG 的A 碱基为第一位(标记为+ 1 ), 在+ 4 位核苷酸为G, 在- 3 位核苷酸为T, 符合Kozak序列( gccRccAUGG ), 其中R是一种嘌呤(腺嘌呤和鸟嘌呤) , 研究表明, Kozak序列在翻译的起始起着重要作用。用Protein Blast对蛇苔生物素羧基载体蛋白序列进行同源性分析的结果表明,蛇苔生物素羧基载体蛋白的核酸序列与其他植物,如蓖麻(XP002517590)、拟南芥(NP564612)、葡萄（XP002285378)和苜蓿（XP003597852）的相似性分别为50% 、48% 、49%和52% 。2. 2 生物素羧基载体蛋白的理化性质用ORF Finder和ProtParam等在线软件对蛇苔、拟南芥和云杉中生物素羧基载体的理化性质进行分析的结果(表1)表明,氨基酸序列长度和分子量数目基本一致.编号Locus氨基酸Nuber ofamino acids分子量数目Molecular weight /KDa理论等电点TheoreticalpI负电荷氨基酸数目Number of negatively charged residues 正电荷氨基酸数目Number of positiv-ely charged residues消光系数Extinctioncoefficients/M-1 cm-1半衰期Estim-atedHalf-life/h hal稳定系数Instabil- ity index蛇苔Conocepha lumconicum拟南芥Arabidopsis thaliana云杉Picea sitche-nsisNP_564612 ABK221077776768342.58407.6 8096.3 5.276.44 6.38 111199119997010095 44704595 69907115 1.1 5.510025.9858.26 39.20 表1 不同植物生物素羧基载体蛋白的理化性质2. 3 蛇苔BCCP氨基酸序列的亲水性/疏水性分析 亲水性/疏水性是氨基酸的重要特性, 疏水性氨基酸残基在蛋白质的内部, 而亲水性氨基酸残基一般在外部, 这对蛋白质的三维结构和蛋白质与蛋白质之间的相互作用起着重要影响。因此, 亲水性/疏水性的预测和分析对蛋白质结构的预测与功能分析均可提供参考。采用ProtScale软件对蛇苔BCCP的亲水性/疏水性分析的结果(图3)表明, 第83的颉氨酸(Val)的疏水性最强(分值1.889), 第111位的颉氨酸(Val)亲水性最强( 分值都为-1.722).从总体上看, 亲水氨基酸和疏水氨基酸的数目相差不大，但亲水氨基酸数目略大于疏水氨基酸数目，因此蛇苔生物素载体蛋白是亲水蛋白。 图3 根据蛇苔BCCP的氨基酸序列预测的亲水性和疏水性2. 4 蛇苔生物素羧基载体蛋白的亚细胞位点和N端信号肽分析蛋白质在细胞中的定位与其执行的功能密切相关。采用Wolf Psort Prediction程序对蛇苔BCCP亚细胞定位进行预测, 结果表明, 蛇苔BCCP基因编码的蛋白质定位于细胞质中(表2)。Predicted Location细胞质cytoplasmic叶绿体chloroplast细胞核nuclear过氧化氢酶体peroxisomal细胞膜Plasma-membrancescore7.03.01.01.01.02.5 蛇苔BCCP的翻译后修饰和其三级结构预测 蛋白质的翻译后修饰( PTM ) 是一个重要的细胞调控机制, 它可以改变蛋白质的理化性质、折叠、构造和功能等。随着蛋白质组学的不断发展,对这方面的研究越来越深入, 这将会促进对细胞调控的进一步了解。用Geno3D和SWISS MODEL在线软件对蛇苔生物素羧基载体蛋白三级结构进行分析，结果表明：。2.6 蛇苔生物素羧基载体蛋白的功能区预测 通过Blast Conserved Domains对蛇苔BCCP的保守区进行分析的结果显示,该保守区大约在第83到184位氨基酸之间 .通过用。软件比对预测在蛇苔生物素羧基载体蛋白，结果表明：Gly140为生物素结构的活性位点，Gly130 、Lue139 、Gly140、Asp148为羰基转移酶结合