猪致病大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验.doc

四川农业大学本科生毕业论文（设计）开题报告毕业论文（设计）题目猪致病性大肠杆菌分离鉴定及药敏试验选题类型基础型课题来源自选项目学 院动物医学院专 业生物工程指导教师杨泽晓职 称副教授姓 名赵耀年 级2011学 号20110755开题报告（立题依据、研究的主要内容及预期目标、研究方案、论文进度安排、主要参考文献）1.立题依据 大肠杆菌是人及动物肠道的正常寄居菌，构成肠道正常菌群的主要部分，并具有重要的生理作用。人和动物出生后数小时大肠杆菌即可经口进入消化道后段，大量繁殖、定居，终生伴随，并经粪便不断散播到周围环境。大肠杆菌在人和动物的肠道内，大多数在正常条件下是不致病的共栖菌，少数与人和动物的大肠杆菌病密切相关，根据致病作用可将大肠杆菌分为五大群，即肠道产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)、产类志贺毒素大肠杆菌(SLTEC)，败血性大肠杆菌(SEPEC)，肠道致病性大肠杆菌(EPEC)和尿道致病性大肠杆菌(UPEC)。其中ETEC 在猪的病原学上有极为重要的意义, 在仔猪腹泻病病原中, 约有40% 的病例由ETEC 引起, 而在我国则约为35%1，当机体免疫力下降或菌体侵入肠外组织时，能引起严重腹泻和败血症，甚至造成死亡，对于新生仔猪，能引起仔猪黄、白痢和成年猪水肿病，且发病率和死亡率均较高，是一类重要的人畜共患病。仔猪腹泻是兽医临床上的多发病、常见病，是引起仔猪死亡的主要原因之一2。 大肠杆菌为需氧或兼性厌氧菌，最适生长温度为37，最适生长pH为72-74，对营养要求不高，在普通培养基或人工合成培养基上均能良好生长，大肠杆菌能发酵多种碳水化合物产酸产气，如可迅速分解葡萄糖、乳糖等多种碳酸化合物，约半数菌株不分解蔗糖。还原硝酸盐，产生靛基质，几乎不产生硫化氢，不分解尿素。除乳糖发酵试验外，吲哚形成试验、甲基红反应、VP试验和枸橼酸盐利用等4项试验(IMVIC试验)是卫生细菌学中常用的检钡0指标。吲哚和甲基红试验均为阳性，VP试验和枸橼酸盐利用试验均为阴性，即IMVIC为“+-”。大肠杆菌的抵抗力中等，各菌株间可能有差异。常用消毒药在数分钟内即可杀死本菌。在潮湿，阴暗而温暖的外界环境中，本菌的存活不超过1个月，在寒冷而干燥的环境中存活较久。各地分离的大肠杆菌菌株对抗药物的敏感性差异较大，且易产生耐药性3。猪大肠杆菌病是由病源性大肠埃希氏菌引起猪的传染性疾病的总称。由于病源性大肠杆菌的血清型不同和猪的年龄、生理机能和免疫状态等差异，猪大肠杆菌病主要表现为肠炎、肠毒血症、水肿等多种临床症状，其中仔猪引起的常见疾病可分为仔猪黄痢、仔猪白痢和猪水肿病三种。猪大肠杆菌病在世界各地均存在，仔猪黄、白痢为猪场中最常见的传染病，其发病率、死亡率均居仔猪疫病之首，给养猪业带来极大危害和经济损失。大肠杆菌病发生后多采用抗生素类药物进行治疗，使得大肠杆菌病得到一定的控制。但是，由于抗生素的广泛及不合理使用，细菌耐药性日益严重，特别是多重耐药性问题更加突出。此外，为预防该病，国内外虽然研制了各种类型的基因工程菌苗与多价灭活菌苗，但由于大肠杆菌的血清型复杂，各个地方的流行菌株各不相同，免疫效果并不理想，一般以自制的灭活菌苗效果更好。由于本病发生的原因很多，常表现为多种因素相互作用的结果，有时呈交叉感染，导致临床防治困难，引起仔猪大量死亡，给养猪业带来巨大的经济损失。因此，如何采取有效的措施预防和控制规模化猪场大肠杆菌病已成为养猪业生产的一项重要课题4。在防治猪大肠杆菌病的同时, 要注意细菌的耐药性主要是由质粒决定的。由于各耐药质粒基因不同, 而导致不同的耐药性。一旦发生仔猪黄、白痢, 应分离细菌并进行药敏试验,筛选出最佳抗菌药物, 切忌盲目给药5。一些大型集约化养殖场，饲养密度过大，通风换气不良，卫生和消毒不彻底，是加速本病流行的不容忽视的主要因素6。为了熟悉并掌握微生物诊断、分离、纯化、培养等相关技术，我们就一雅安某猪场送检的猪内脏病料进行大肠杆菌的分离鉴定，期望为大肠杆菌感染相关疾病的防治提供一定的参考依据。2.研究的主要内容及预期目标本次实验研究的主要内容是对仔猪病变器官进行致病性大肠杆菌的分离，并进行鉴定、纯化、培养、生化鉴定、药敏实验和小鼠致病性实验。 预期目标分离纯化致病性大肠杆菌1株，进行生化鉴定、药敏试验和致病鉴定。3.研究方案3.1试验材料3.1.1病料： 雅安某猪场患病仔猪内脏器官3.1.2培养基：（1）麦康凯琼脂培养基蛋白胨17g 脙胨 3g猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g氯化钠 5g 琼脂17g蒸馏水1000mL 乳糖10g0.01%结晶紫水溶液10mL0.5%中性红水溶液5mL将蛋白胨、胨、胆盐和氯化钠溶解于400mL蒸馏水中，校正pH7.2。将琼脂加入600mL加热溶解。将两液合并，分装于烧瓶内，121高压灭菌15min备用。临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖，冷至5055时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板(注：结晶紫及中性红水溶液配好后须经高压灭菌) 。（2）肉汤培养基蛋白胨10.0g 牛肉粉3.0g氯化钠5.0g pH值7.20.2称取本品18.0g加热溶解于1000ml蒸馏水中,分装三角瓶或试管,121高压灭菌15分钟备用。（3）血平板取营养琼脂（PH76），加热使其溶解待冷至45-50，以灭菌操作于每100毫升营养琼脂加灭菌脱纤维羊血或兔血5-10毫升,轻轻摇匀，立即倾注于平板或分装试管，制成斜面备用。3.1.3试剂：草酸铵结晶紫染液，革兰氏碘溶液，石炭酸，95%的酒精3.1.4实验动物：健康小白鼠3.2试验方法： 3.2.1样品采集由雅安某猪场送检的病料，观察病料肝肺组织的变化，可视黏膜颜色；以及心包，心肌，心内外膜是否有出血点；肺实质是否有出血变性，肝脏质地变化，是否肿大出血。3.2.2细菌分离培养无菌采取病死猪的肝、肺组织，分别培养于血琼脂上，37 24 h 后观察菌落。刮取大小不等的菌落涂片，革兰氏染色，镜检。革兰氏染色法：在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，经12 min，水洗（在进行各种染色时都应该注意，在抹片上滴上染色液染色后，不可直接将剩余染液倾去，应用水连同染液一起冲洗去，然后进行下一步骤，以免发生沉渣黏附，影响染色效果）；加革兰氏碘溶液于抹片上媒染作用13 min，水洗；加95%的酒精于抹片上脱色，约30 s1 min，水洗；加稀释石炭酸复红（或沙黄水溶液）复染1030 s，水洗；吸干或自然干燥，镜检，革兰氏阳性菌呈现蓝紫色，革兰氏阴性菌呈现红色。3.2.3细菌纯化培养挑取血琼脂上可疑菌落，接种麦康凯琼脂，37 24 h 培养；挑取血平板单菌落接种肉汤培养基，在37 下，培养1824 h，观察菌落的形态、颜色、大小。连续挑菌纯化3次。3.2.3.1生化试验挑取纯化培养物做生化试验、参照伯杰氏细菌鉴定手册进行鉴定，分别进行吲哚试验、MR试验、VP试验、硫化氢试验、尿素试验、葡萄糖、麦芽糖等发酵试验7,8。3.2.3.2药敏试验 取典型菌落均匀涂布于普通琼脂平板上进行药敏试验，药敏试剂氯霉素、丁胺卡那、环丙沙星、磺胺嘧啶、土霉素、青霉素、氨苄青霉素、链霉素。3.2.3.3小鼠致病性实验选取大小适宜，体重15g无病原感染的健康小白鼠（健康状况相同）雌雄各两只平均分成A和B两组每组雌雄各一只，对接种于肉汤培养基的大肠杆菌取0.2ml经腹部皮下注射A组小鼠腹腔，对照试验B组注射同剂量生理盐水，观察并记录小鼠有无致死。具体技术路线如下：4.论文进度安排： 2014年3-5月 查找相关文献资料，构思试验方案，完成开题报告 2014年6-7月 完善试验方案并在实验室完成前期准备 大肠杆菌分离鉴定及药敏的试验 2015年1月 分析记录实验结果撰写论文 论文答辩5.参考文献1苟万里，周碧君，冯元璋猪大肠杆菌病病原学研究进展J仲恺农业技术学院学报, 1998,11(3):63- 702 钱锋仔猪出血性大肠杆菌病的诊断与防治J上海畜牧兽医通讯，2009，(4)：1013陈甜甜，刘建柱，杨忠福猪大肠杆菌病研究进展J猪业科学，2008(8):20-244冷冬一例猪大肠杆菌病的试验报告J 现代畜牧兽医2011，(15):34-365马冬雪,姚瑶,胡奕猪致病性大肠杆菌致病机制及综合防治研究进展J安徽农业科学，2010, 38(17):9013- 90156王洪波，王鹏猪大肠杆菌病的诊断与治疗