实验四 用遗传标记鉴定水稻品种的亲缘关系.doc

实验四 用遗传标记鉴定水稻品种的亲缘关系一、目的1、了解袁隆平的杂交水稻三系配套和杂种优势利用的基本理论。2、遗传标记用于水稻三系及杂种F1间亲缘关系的初步鉴定的基本原理3、初步掌握PCR和琼脂糖凝胶电泳技术二、原理1、三系配套、杂种优势和遗传标记用于水稻品种亲缘关系鉴定的基本理论和原理植物在生长发育过程中，由于受环境条件影响或自身遗传突变导致雄性生殖系统退化不能产生花粉或者产生的花粉缺乏正常的功能，而雌性生殖系统发育正常的一种生物学现象，称为雄性不育。植物雄性不育在自然界普遍存在，据统计，已经在43个科、162 个属、320个种的617个种和种间杂种中发现了雄性不育现象（徐秉芳，2000）。如果雄性不育遗传方式符合孟德尔遗传规律的，称核雄性不育（Genic male sterility，简称GMS）；如果以母性方式遗传，则称之为细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility，简称 CMS）(Kaul, 1988)。袁隆平的最大贡献在于最早实现生产上大面积应用的杂交水稻三系配套。所谓的杂交水稻三系是指（细胞质）雄性不育系（A表示）、保持系（B表示）和恢复系（R表示），不育系是以细胞质母性方式遗传的，不育基因现在基本确定是线粒体基因。不育系与强恢复系杂交后经人工选择可获得产量、品质和抗病性等均有明显超越亲本性状的杂种F1代，可用于生产应用，这就是杂种优势利用。可是，不育系（A）本身不育，一季后就无法大量保存（可以用稻兜保存），生产上也就无法大面积应用。保持系（B）与不育系杂交则能结种子，而且结的种子在长成植株后又是与原来的不育系完全是一样的，也就是保持系（B）能使不育系大量地繁殖以适合于生产应用。不育系（A）与保持系（B）的区别基本上是不育系存在不育基因，而保持系不存在不育基因。恢复系（R）与不育系（A）基本上是毫不相关的品种，当然恢复系也是没有不育基因的。不育系的不育基因基本确定是线粒体（细胞质）基因，因而不育系（A）与恢复系（R）杂交后代F1应该含有不育基因，F1长成植株后本身是可育的，主要原因是恢复系提供的细胞核基因能恢复它的育性。生产上应用的是F1杂交种子，而生产F1杂交种子成本较高，因而商业经营上可能会有人以恢复系（恢复系本身往往是曾经或正在生产上应用的品种，自交收种子就行，成本低）代替。为了大致区分水稻细胞质雄性不育系（A）、保持系（B）、恢复系（R）和杂种F1种子，我们可以根据已知的不育系（A）的不育基因设计引物，分别以A、B、R和F1全基因组DNA为模板，经过PCR和电泳检测，有目的PCR产物带的是不育系A和杂种F1，无目的带的是保持系B和恢复系R，这样就基本上可以将杂种F1与恢复系R初步区分出来。2、PCR反应原理 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，它是近年发展起来的一种体外扩增特定目的DNA片段的技术。PCR技术实际上是在模板DNA、引物和种脱氧核糖核苷酸(dNTP)存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA 结合的特异性。反应分3步：变性：通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。延伸：在DNA聚合酶和4 种dNTP底物及Mg2+存在的条件下，53的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，2-3小时之后，介于两个引物之间的特定目的DNA片段得到了大量复制，数量可达21067拷贝。3、琼脂糖凝胶电泳检测的基本原理 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。 在pH值为8.08.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。三、材料 粤泰A、粤泰B、9311（恢复系R）和红莲优6（杂种F1）的全基因组DNA。四、主要的器具、药品试剂主要仪器设备：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、微波炉主要药品试剂：PCR反应：1. 上下游引物: 浓度为各10 pmol/l。 F: ATG GCA AAT CTG CTC CGA TGG CTC R: TTA CTT AGG AAA GAC TAC ACG orfH79sequence: （不育基因序列）ATGACAAATCTGCTCCGATGGCTCTTCTCCACTACCCGAGGGACTAACGGTCTTCCATATTTCATCTTCGGTGTCGTTGTAGGAGGCGCCCTGTTGTTTGCTTTGCTAAAGTATCAGGCCCCTCTGTACGACCCGGCTTTATTGGACAAAATCATAGATCATAATATAAAAGCCGGGTACCCTATAGAGGTTGACTATTCGTGGTGGGGCACCTCTATTCGTGTAGTCTTTCCTAAGTAA 2DNA模板浓度为100ng/l。310buffer（购买Taq酶配套buffer）：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-Cl，pH9.0，1% Triton-X 1004MgCl2：25mmol/L。5dNTP 2.5mmol/L：分别取等体积10mol/L的dATP，dGTP，dTTP，dCTP混合即成6Taq DNA聚合酶：浓度为2.5 U/l。7灭菌双蒸水 电泳：1. 琼脂糖2. 6载样buffer 0.25% 二甲苯青FF，0.25% 溴酚蓝，30% 甘油350TAE 电泳Buffer 12.2g Tris，2.85ml 冰醋酸，10ml 0.25 mol/L EDTA(pH8.0)，加水至50ml。4溴化乙锭(EB)溶液 10mg/ml(避光保存)，每100ml琼脂糖凝胶加5l贮存液，即凝胶中EB终浓度为0.5g/ml，此试剂为强致癌物，要戴手套操作，避免污染环境。5. DNA Marker：共6条带，2000bp、 1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。上样6ul时750bp的带约为100ng，其余带约为50ng6各种国产移液器(10，20，100l)7消毒的tips枪头8水平电泳槽和电泳仪五、实验操作（一）PCR：各种试剂置冰盒中，取已灭菌的0.2ml PCR管，于冰上按下表操作：（20l反应体系）试剂加入量终浓度(或含量)DNA模板2l100ng10buffer4l1bufferdNTP2l2.5mmolMgCl21l约2.5mM/L上下游引物2l（各10 pmol/l）各10pmolTaq DNA聚合酶1l (2.5 U/l)1.25U无菌ddH2O补足20l总体积20l 用枪混匀反应液，稍离心，盖紧盖子，编号。于PCR仪上进行PCR反应。反应程序设置为：94 预变性 5min 以下35次循环 94 变性 30S 55 退火 30s 72 延伸 60s 循环后 72 5min（二）、琼脂糖凝胶电泳检测1、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于锥形瓶中,加入50ml 1TAE稀释缓冲液,放电炉上加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。 2、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用挡板隔出需要制胶的空间，将胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封挡板内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入1TAE缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。 4、加样：取1l PCR产物DNA溶液与适量载样缓冲液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。PCR产物加样完毕，选取一个未加样点样孔加入6ul DNA Marker。注意每加完一个样品要更换tip枪头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。5、电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在5V/cm。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约21cm时,停止电泳。 6、染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5g/ml的EB溶液中,室温下染色20-25分钟。 7、观察：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨