金益柏图文并茂教你ELISA试剂盒结果分析.docx

1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。金益柏ELISA试剂盒使用后得出结果该怎么分析呢，今天为大家介绍下1. ELISA实验中样品都要做复孔或三孔，然后计算每个浓度标准品的平均OD值，复孔的变异系数应该小于20%。2. 平均OD值减去空白孔的OD值。3. 制作标准曲线。以减去本底后的OD值为X轴，标准品的浓度为Y轴，利用作图软件得出一个合适的计算方法。建议使用合适的软件来作图，比如CurveExpert 1.4。这款软件能够给出很多种方法(比如直线、半对数、对数、四参数方程等)并从中选择一条最合适的方程。要想检验某条曲线是否与表中数据吻合，可以将标准品的浓度作为未知数，将对应的OD值带入该方程，计算出标准品的浓度，得到的结果应该与实际浓度很接近(+/-10%)。选择拟合度最高的那条曲线。以下是CurveExpert1.4的使用过程：一将OD值和标准品浓度数据复制粘贴到表格中二生成和选择标准曲线三通过曲线计算样品浓度四输入OD值，点击“计算”按钮，得到样品的准确浓度。或者得到相关方程，通过excel来计算浓度。如果需要导出方程，可点击“复制”，粘贴至excel中。五对于OD值落在标准曲线之外的情况如果样品的OD值超过标准曲线的最高值，在实验前应该先将样品稀释从而得到准确的浓度。样品的最终度应该是计算出的浓度乘以稀释倍数。夹心法夹心法常用于检测大分子抗原，一般之操作步骤为:将具有专一性之抗体固著（coating）于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体加入待测检体，检体中若含有待测之抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一之一次抗体，与待测抗原进行键结洗去多余未键结一次抗体，加入带有酵素之二次抗体，与一次抗体键结洗去多余未键结二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果间接法间接法常用于检测抗体，一般之操作步骤为：将已知之抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余之抗原。加入待测检体，检体中若含有待测之一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结。洗去多余待测检体，加入带有酵素之二次抗体，与待测之一次抗体键结。洗去多余未键结二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，藉仪器（ELISA reader）测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。竞争法竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为：将具有专一性之抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结加入带有酵素之抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酵素之抗原可键结的固著抗体就越少，亦即，两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结，即所谓竞争法之由来。洗去检体与带有酵素之抗原，加入酵素受质使酵素呈色，当检体中抗原量越多，代表