浙科版选修1 实验12 乳酸脱氢酶同工酶的分离 课件（29张）.pptx

第四部分浅尝现代生物技术 实验12乳酸脱氢酶同工酶的分离 学习目标 1 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理 2 熟悉聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离蛋白质的操作技术 乳酸脱氢酶同工酶 同工酶 来源于同一个体或组织 能催化同一反应 而蛋白结构不同的酶 广义是指生物体内催化相同反应而分子结构不同的酶 乳酸脱氢酶目前发现有五种同工酶 它们都能催化乳酸脱氢产生丙酮酸 分别是ldh1 ldh2 ldh3 ldh4 ldh5 根据五种同工酶分子结构以及理化性质的不同 pi各不相同 在同一sds page中 在电场中移动速度不同 可用电泳法将其分离 生理及临床意义 1 在代谢调节上起着重要的作用 2 用于解释发育过程中阶段特有的代谢特征 3 同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断 4 同工酶可以作为遗传标志 用于遗传分析研究 聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 是由单体丙烯酰胺 acr 和交联剂n n 亚甲基双丙烯酰胺 bis 在催化剂过硫酸铵 ap 和加速剂n n n n 四甲基乙二胺 temed 作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶 temed催化ap生成硫酸自由基 以ap为催化剂 以temed为加速剂 硫酸自由基的氧原子激活acr单体并形成单体长链 bis将单体长链间连成网状结构 聚丙烯酰胺凝胶类型 1 连续系统 是指电泳系统采用相同孔径的凝胶 缓冲系统等条件下进行区带电泳 是利用蛋白质分子的电荷效应进行分离 凝胶的分子筛效应不明显 一般只用于分离一些比较简单的样品 缺点是分辨率不高 2 不连续系统 是指使用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式 在电泳分离过程中 由于浓缩胶的堆积作用 可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带 对样品进行浓缩 然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离 既存在电荷效应 也有分子筛效应 虽然制胶操作难度较大 但是它具有连续系统不可比拟的优越性 分辨率高 不连续电泳的四个不连续性 凝胶浓度的不连续性 缓冲液离子成分的不连续性 缓冲液ph梯度的不连续性 电位梯度的不连续性 蛋白质在净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素 电荷因素 蛋白质分子形状和大小相同 所带电荷性质和数量不同 分子大小 蛋白质分子形状和所带电荷和数量相同 分子大小不同分子形状 蛋白质所带电荷和数量相同 分子形状不同 乳酸脱氢酶同工酶活性染色 用活性染色对ldh进行鉴定 将凝胶浸泡在活性染色液中 ldh与底物的反应 用吩嗪二甲酯硫酸盐 pms 作为电子的中间载体 氯化硝基四氮唑蓝 nbt 作为最终电子受体 底物脱下的氢最后传递给nbt nbt被还原后 产生蓝紫色的不溶于水的物质以对ldh定位 实验内容 分离胶的制备 浓缩胶的制备 待分离样品的处理 加样 电泳 染色 1 分离胶制备 分离胶溶液 ml 蒸馏水 6 2ml 分离胶缓冲液 1 25ml 30 母液 2 5ml temed 10 ap 0 03ml 0 1ml 摇匀 混匀 并用蒸馏水封住胶面 静置凝合后 倾去水层 用细条滤纸吸干残余水分 2 浓缩胶制备 浓缩胶溶液 ml 蒸馏水 7 7ml 浓缩胶缓冲液 1 25ml 30 母液 1 0ml temed 10 ap 0 03ml 0 1ml 摇匀 混匀 将胶灌在分离胶之上 并用蒸馏水封住胶面 静置凝合后 倾去水层 用细条滤纸吸干残余水分 3 样品处理 取血清1ml 加入1ml样品缓冲液 混合后供电泳使用 4 加样 将凝胶管垂直插入电泳槽上 加样 每管50ul 勿弄破胶面 然后在样品液层上小心地加入电泳缓冲液 勿搅动样品层 5 电泳 凝胶管的上下端分别浸入上下槽缓冲液后 接上电泳 上槽接负极 下槽接正极 开始电泳10分钟内加电流1ma 每管 样品进入分离胶 电流升至2ma 每管 电泳2 4小时 直到溴酚蓝前沿到达距凝胶下端约0 5cm时 关闭电源 停止电泳 取出凝胶管 6 剥胶 用带长针头的注射器针筒吸满水 然后将针头沿着玻管壁把水推进并旋转玻管 使胶自由滑出 7 染色 将剥出胶柱浸入染色液中 并在37度水浴中保温至酶带显出 大约5 10分钟 注意事项 1 封管要严 防止漏液 2 固定玻璃管要竖直 3 凝胶制备时 temed和ap要后加 加入后用玻棒缓慢匀速的混匀 避免有气泡产生 4 配胶后立即灌胶 1 乳酸脱氢酶能使乳酸发生下列的哪一变化 a 乳酸脱氢产生丙酮酸b 使氧化型辅酶nad 分解c 使乳酸氧化生成co2 h2od 使乳酸分解成乙醇 随堂练习 解析 本题考查乳酸脱氢酶的作用 根据教材中对其的描述 乳酸脱氢酶 ldh 可以发生以下变化ch3 choh cooh nad 乳酸 氧化型辅酶nad ch3 co cooh nadh h 丙酮酸 所以 正确的答案是a 答案 a 2 下面对同工酶概念的说法 正确的是 a 能将不同物质催化反应为同一物质的一组酶b 能催化同一化学反应 但其酶蛋白分子的组成却不同的一组酶c 所起的作用都是催化作用的一组酶d 催化同一个物质生成的物质却不同的一组酶 解析 根据同工酶的概念所述 同工酶是指催化同一化学反应 但其酶蛋白的分子组成却不同的一组酶 所以选项b是正确的 答案 b 3 下列属于乳酸脱氢酶 ldh 催化得到的物质是 乳酸 nadh nad h 丙酮酸a b c d 解析 根据下图可知 ch3 choh cooh 乳酸 nad ldh 乳酸脱氢酶ch3 co cooh 丙酮酸 nadh h 生成物为3个 丙酮酸 nadh h 答案 b 4 关于同工酶的叙述 不正确的是 a ldh各种同工酶的化学本质都是蛋白质b ldh共有5种