浙科版选修1 实验13 DNA片段的PCR扩增 课件（32张）.pptx

第四部分浅尝现代生物技术实验13dna片段的pcr扩增 定义 在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组dna序列进行的体外扩增反应 技术优点 特异 敏感 产率高 快速 简便 重复性好 易自动化等 原理 regiontobecopied denaturatation primerannealing primerextension cycle2 cycle3 pcr技术原理 类似于dna的天然复制过程 其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物 模板dna变性 加热至94 左右 双链dna解离成单链 模板dna与引物的退火 复性 55 左右 引物与模板dna单链的互补序列配对结合 2 复性 系统温度下降到40 60 时 两种引物通过碱基互补配对与两条单链dna结合 如图 3 延伸 当系统温度上升到72 左右时 溶液中的四种脱氧核苷酸 a g c t 在dna聚合酶的作用下 根据碱基互补配对原则合成新的dna链 如图 特别提醒 1 pcr一般要控制在25 35个循环 每次循环都包括变性 复性 延伸三步 2 两引物之间的固定长度的dna序列呈指数扩增 引物的延伸 在taqdna聚合酶作用下 以dntp为原料 靶序列为模板 按碱基配对与半保留复制原理 合成一条新的双链 重复循环变性 退火 延伸三过程 使dna扩增量呈指数上升 pcrproduct pcr反应曲线 标准反应体系 10 扩增缓冲液10 l4种dntp混合物各200 mol l引物10 100pmol模板dna0 1 2 gtaqdna聚合酶2 5u mg2 1 5mmol l加双或三蒸水至100ul 热循环条件的选择 pcr反应条件 温度时间循环次数 温度与时间的设置 设置变性 退火 延伸三个温度点 标准反应中采用三温度点法 1 93 95 变性 2 40 60 退火 3 70 75 延伸对于较短靶基因 长度为100 300bp时 可采用二温度点法 一般采用94 变性 65 左右退火与延伸 变性温度与时间 变性温度低 解链不完全是导致pcr失败的最主要原因一般93 94 lmin足以使模板dna变性若低于93 则需延长时间 但温度不能过高 高温环境对酶的活性有影响 退火 复性 温度与时间 退火温度是影响pcr特异性的较重要因素退火温度与时间 取决于引物的长度 碱基组成及其浓度 还有模板的长度 复性温度 当引物长度为15 20个碱基时 在高离子强度中反应 如1mnacl tm 4 g c 2 a t 复性温度 tm值 5 10 一般30 60sec 足以使引物与模板间完全结合 复性温度 延伸温度与时间 温度 一般70 75 常用温度为72 时间 根据待扩增片段长度而定 1kb以内的dna片段 延伸时间1min 循环次数 决定pcr扩增程度主要取决于模板dna的浓度选在25 40次之间 例1近十年来 pcr技术 多聚酶链式反应 成为分子生物学实验室里的一种常规手段 其原理是利用dna半保留复制 在试管中进行dna的人工复制 如图 在很短的时间内 将dna扩增几百万倍甚至几十亿倍 使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体 典例学习 1 加热使dna双链打开 这一步是打开 键 称为 2 当温度降低时 引物与模板 端结合 在dna聚合酶的作用下 引物沿模板延伸 最终合成两个dna分子 此过程中原料是 遵循的原则是 3 pcr技术的必要条件 除了模板 原料 酶以外 至少还需要三个条件 即 液体环境 适宜的温度和酸碱度 适宜的温度由 自动调控 酸碱度则靠 来维持 4 dna的复制需要引物 其主要原因是 a 可加快dna的复制速度b 引物可与dna母链通过碱基互补配对结合c 引物的5 端有助于dna聚合酶延伸dna链d dna聚合酶只能从3 端延伸dna链 解析 1 pcr技术利用热变性原理使dna双链间的氢键断裂 称为变性 2 pcr技术扩增dna与细胞内dna复制所需原料一样 为腺嘌呤脱氧核糖核苷酸 鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸 胞嘧啶脱氧核糖核苷酸 胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸 遵循的原则是碱基互补配对原则 引物与模板的3 端结合后 dna聚合酶才发挥作用 3 pcr技术除了需要模板 原料 酶以外 至少还需要液体环境 适宜的温度和酸碱度 适宜的温度靠pcr仪自动调控 而酸碱度靠缓冲液来维持 4 引物的作用是结合在模板dna上 提供dna延伸的起始位点 而dna聚合酶的作用是从引物的3 端开始催化dna链的延伸 故选d 答案 1 氢变性 2 3 四种脱氧核苷酸碱基互补配对原则 3 pcr仪缓冲液 4 d 名师点睛 1 加热变性是由于加热使碱基之间的氢键断开 而不是脱氧核糖与磷酸之间的键断开 2 引物的作用是结合在模板dna上 为dna延伸提供起始位点 下列有关pcr的描述 不正确的是 a 是一种酶促反应b 反应需要引物c 扩增产量为y 1 x nd 扩增对象是氨基酸序列 变式训练 答案 d 例2pcr过程与细胞内的dna复制过程相比 主要有两点不同 它们是 pcr过程需要的引物是人工合成的单链dna pcr过程不需要dna聚合酶 pcr过程中dna的解旋不依靠解旋酶 而是通过对反应温度的控制来实现的 pcr过程中 dna不需要解旋 直接以双链dna为模板进行复制 a b c d 解析 pcr过程与细胞内的dna复制过程相比较 主要有两点不同 1 pcr过程需要的引物是人工合成的单链dna 长度通常为20 30个核苷酸 2 pcr过程中 dna解旋不依赖解旋酶 而是通过对反应温度的控制来实现的 答案 c 名师点睛 细胞内dna复制与pcr技术的原理和过程容易发生混淆 特别应注意区分pcr反应需要可变的温度 而体内dna复制需要稳定的温度 符合pc