血红蛋白的提取与分离91472.ppt

血红蛋白的提取与分离 一 课题目标本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离 使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法 并了解色谱法 电泳法等分离生物大分子的基本原理 为今后学习运用这些技术打下基础 二 课题重点与难点课题重点 凝胶色谱法 电泳法的原理 课题难点 自学 样品的预处理 色谱柱填料的处理和色谱柱的装填 思考1为什么要分离蛋白 科研生产 思考2蛋白质的分离和提取的原理是什么 根据蛋白质各种特性的差异 如分子的形状和大小 所带电荷的性质和多少 溶解度 吸附性质和对其他分子的亲和力等等 可以用来分离不同蛋白质 什么是色谱法 它的用途是什么 利用混合物中各组分的理化生性质的不同 有哪些 使各组分以不同程度分布到两相中的分离技术 叶绿素的分离 一 基础知识 凝胶色谱法 分配色谱法 1 凝胶 一些微小多孔的球体 内含许多贯穿的通道 由多糖类化合物构成 如葡聚糖 琼脂糖 具多孔的凝胶就叫分子筛 2 凝胶色谱法的概念根据被分离的蛋白质相对分子质量的大小 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用 来进行蛋白质分离 讨论 为什么小分子必须走空隙 3 原理 当不同的蛋白质通过凝胶时 相对 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道 路程 移动速度 而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道 只能在 移动 路程 移动速度 相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离 分子质量较小 较长 较慢 相对分子质量较大 凝胶外部 较短 较快 课后思考 怎样选择交联度 层析系统 每一部件的作用 思考 凝胶层析应该用那种柱子 电泳 1 概念 指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 2 原理 许多重要的生物大分子 如 等都具有 在 下 这些基团会带上 在电场的作用下 这些带电分子会向着与其 电极移动 电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身的 的不同使带电分子产生不同的 从而实现样品中各种分子的分离 多肽 核酸 可解离的基团 正电或负电 所带电荷相反的 带电性质的差异 大小 形状 迁移速度 一定的PH 思考 电泳与凝胶层析驱动力的不同 聚丙烯酰胺凝胶 是由单体丙烯酰胺和交联剂N N 甲叉双丙烯酰胺在引发剂 过硫酸铵 和催化剂 四甲基已二胺 的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶 3 分类 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳 测定 时 通常用十二烷基硫酸钠 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白质相对分子质量 为了消除净电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入 SDS能使蛋白质发生完全变性 由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链 因此测定的结果只是 SDS能与各种蛋白质形成蛋白质 SDS复合物 SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量 因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别 使电泳迁移率完全取决于 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素 SDS 单条肽链的分子量 分子的大小 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS PAGE polyacrylamidegelelectrophoresis使用含有十二烷基硫酸钠 SDS 和还原剂 通常为巯基乙醇 的样品处理液对蛋白质样品进行处理 一般煮沸3 5分钟 通过加热和SDS可以使蛋白质变性 多亚基的蛋白质也将解离为单亚基 同时还原剂可以切断蛋白质中的二硫键 使二硫键还原 经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连接的 分离的状态 由于SDS是带有负电荷的分子 同时它有一个长的疏水尾巴 SDS通过疏水尾巴与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合 结合SDS的比率大约是一个蛋白质分子中每两个氨基酸残基结合一分子的SDS 垂直板电泳装置 加样 样品迁移方向 电泳过程中分子迁移的规律 小分子走在前头 大分子滞后 电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒 混合样品 带孔胶 按分子大小分离 电泳方向 电泳 小分子 大分子 夹在两块玻璃板之间的凝胶 电泳缓冲液 电泳缓冲液 加在槽中的经SDS处理的样品 分子量小 分子量大 电源 标准蛋白分子量 未知蛋白 在一定的凝胶浓度下 多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系 所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量 相对迁移率 电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色 脱色后的凝胶照片 聚丙烯酰胺凝胶电泳对分离大分子具有较高的分辨率 但核酸比蛋白质分子大得多 只能采用较大孔径的琼脂糖凝胶电泳 核酸分子本身含有大量的磷酸根 核酸带负电荷 在电场中向正极移动 溴化乙啶荧光染料对核酸染色在紫外线的照射下 发出橙红色荧光 根据荧光条带的粗细和分布的位置 可以用在对PCR扩增效果的鉴定上 说明 思考 凝胶层析和SDS PAGE的原理有那些相似性 谢谢 二 实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步 1 样品处理 样品处理 粗分离 纯化 纯度鉴定 90 目的 去除 以利于后续步骤的分离纯化 方法 离心 速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果 然后用胶头吸管吸出上层透明的 将下 每条肽链环绕 此基团可携带 血红蛋白因含有 而呈红色 一个亚铁血红素基团 一分子氧或一分子CO2 血红素 1 红细胞的洗涤 杂蛋白 低速短时间 黄色血浆 1 样品处理 层 的红细胞液体倒入烧杯 再加入五倍体积的 质量分数为0 9 的氯化钠溶液 缓慢搅拌10min 低速短时间离心 如此重复洗涤 次 直至上清液中没有 表明红细胞已洗涤干净 生理盐水 三 黄色 暗红色 2 血红蛋白的释放 加 到 体积 再加40 体积的 溶解细胞膜 置于 上充分搅拌10分钟 加速细胞破裂 细胞破裂释放出血红蛋白 3 分离血红蛋白溶液 将搅拌好混合液转移到离心管内 以2000r min的速度离心10min 试管中的溶液分为4层 原血液 甲苯 磁力搅拌器 蒸馏水 第1层 最上层 甲苯层 第2层 中上层 的沉淀层 色薄层固体 第3层 中下层 的水溶液层 的液体 第4层 最下层 其它杂质 的沉淀层 无色透明 脂溶性物质 白 血红蛋白 红色透明 暗红色 用滤纸过滤 除去脂溶性沉淀层 于分液漏斗中静置片刻后 分出下层的红色透明液体 有机溶剂脂类物质血红蛋白溶液红细胞破碎物沉淀 取1mL的血红蛋白溶液装入 中 将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol L的 中 pH为 透析12小时 目的是 或用于更换样品中的 透析袋一般用硝酸纤维素 玻璃纸 制成 除去样品中分子量较小的杂质 透析袋 磷酸缓冲液 7 0 缓冲液 4 透析 2 凝胶色谱操作 1 凝胶色谱柱的制作 取长40厘米 内径1 6厘米的玻璃管 两端需用砂纸磨平 柱底部的制作 打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网 再用100目尼龙纱包好 a 选择合适的的橡皮塞 中间打孔 b 在橡皮塞上部切出锅底状的 在0 5mL的 头部切下 长的一段 插入橡皮塞孔内 上部不得超过橡皮塞的凹穴底面 凹穴 移液管 5cm 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面 否则难以铺实尼龙网 还会导致液体残留 蛋白质分离不彻底 c 剪尼龙网小圆片覆盖在橡皮塞的凹面上 用100目的尼龙纱将橡皮塞上部包好 插到玻璃管一端 d 色谱柱下端用移液头部做出口部位 连接一细的尼龙管 并用螺旋夹控制尼龙管的打开与关闭 另一端放入收集色谱流出液的收集器内 安装其他附属结构 顶塞的制作 插入安装了玻璃管的橡皮塞 组装 将上述三者按相应位置组装成一个整体 2 凝胶色谱柱填料的处理 1 凝胶的选择 G 75 G 表示凝胶的交联程度 膨胀程度及分离范围 75表示凝胶的得水值 即每克凝胶膨胀时吸水7 5克 2 方法 配置凝胶悬浮液 计算并称取一定量的凝胶浸泡于 中充分溶胀后 配成 蒸馏水 凝胶悬浮液 交联葡聚糖凝胶 固定 将色谱柱垂直固定在支架上 装填 将 一次性的缓慢倒入 内 装填时轻轻敲动色谱柱 使凝胶填装均匀 3 凝胶色谱柱的装填方法 凝胶悬浮液 色谱柱 注意 凝胶装填时尽量紧密 以降低凝胶颗粒之间的空隙 装填凝胶柱时不能有气泡存在 因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序 降低分离效果 你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密 均匀吗 凝胶实际上是一些微小的多孔球体 小球体内部有许多贯穿的通道 相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部 只能分布在颗粒之间 通过的路程较短 移动速度较快 相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道 通过的路程较长 移动速度较慢 因此 样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出 相对分子质量中等的分子后流出 相对分子质量最小的分子最后流出 从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离 如果凝胶装填得不够紧密 均匀 就会在色谱柱内形成无效的空隙 使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过 搅乱洗脱液的流动次序 影响分离的效果 洗涤平衡装填完毕后 立即连接缓冲液洗脱瓶 在约 高的操作压下 用300mL的20mmol L的磷酸缓冲液 pH为7 0 充分洗涤平衡12小时 使凝胶装填紧密 50cm 3 样品的加入与洗脱 加样前 打开下端流出口 使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐 关闭出口 加透析样品 3 样品加入与洗脱 调整缓冲液面 与凝胶面平齐 滴加透析样品 用吸管将1mL透析后的样品加到色谱柱的顶端 样品渗入凝胶床 样品完全进入凝胶层 洗脱 打开下端 用磷酸缓冲液洗脱 收集 待红色的蛋白质接近色谱柱底端时 用试管收集流出液 每5mL收集一试管 连续收集 3 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 选做 判断纯化的蛋白质是否达到要求 需要进行蛋白质的鉴定 血红蛋白是有色蛋白 因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液 这使血红蛋白的分离过程非常直观 大大简化了实验操作 思考 与其他真核细胞相比 红细胞有什么特点 这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义 3 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 鉴定血红蛋白纯度 1 试剂的配制 丙烯酰胺和N N 甲叉双丙烯酰胺用去离子水配制29 29g 100mL 下同 的丙烯酰胺和1 的N N 甲叉双丙烯酰胺的贮存液 十二烷基硫酸钠 SDS 用去离子水配成10 的贮存液 于室温保存 用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液 TEMED 作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合 用去离子水配制10 过硫酸铵 作用提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基 此溶液须配制新鲜液 Tris 甘氨酸电泳缓冲液25mmol LTris 250mmol L甘氨酸 pH8 3 0 1 的SDS 样品处理液50mmol LTris HCl pH6 8 100mmol LDTT 巯基苏糖醇 或用5 的巯基乙醇 2 的SDS 0 1 的溴酚蓝 10 的甘油 染色液0 1 的考马斯亮蓝R250 40 的甲醇 10 的冰醋酸 脱色液10 的甲醇和10 的冰醋酸 由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性 并且容易被皮肤吸收 因此操作必须在通风橱内或通风处进行 TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织 眼睛 皮肤等有很大的破坏作用 吞服可致命 因此在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成 操作时要戴好一次性手套 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置及其原理示意图 SDS 聚丙烯酰胺分离胶制备 1 根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板 2 SDS 聚丙烯酰胺凝胶制备 用去离子水4 6mL 30 的丙烯酰胺2 7mL 1 5mol pH8 8的Tris缓冲液2 5mL 10 的SDS0 1mL 10 的过硫酸胺0 1mL TEMED0 006mL 混合均匀 迅速灌注在两玻璃板的间隙中间 要留出灌注浓缩胶所需空间 梳子的齿长再加0 5cm 再在胶液面上小心注入一层水 约高2 3mm 以阻止氧气进入凝胶溶液 2 电泳方法步骤 配制SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液 用去离子水2 7mL 30 的丙烯酰胺0 67mL 1 0mol pH6 8的Tris缓冲液0 5mL 10 的SDS0 041mL 10 的过硫酸胺0 04mL TEMED0 004mL 混合均匀 直接灌注在聚合的分离胶上 并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子 整个操作过程应注意避免气泡的产生 然后再补加浓缩胶溶液 使其充满梳子之间的空隙 将凝胶垂直放置于室温下聚合 分离胶聚合完全后 约30min 倾出覆盖水层 再用滤纸吸净残留水 3 样品处理 5 加样 在电泳样品中按1 1体积比加入样品处理液 在100 温度下加热3min 以使蛋白质变性 按顺序加样 加样量通常为10 25 L 样品可以多加几个 例如 血浆样品红细胞破碎后 即进行凝胶色谱分离之前 的样品和凝胶色谱分离之后的样品 4 浓缩胶聚合完全后 30min 小心移出梳子 把凝胶固定于电泳装置上 上下槽各加入Tris 甘氨酸电泳缓冲液 必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡 7 剥胶 从电泳装置上卸下玻璃板 用刮刀撬开玻璃板 将紧靠最左边一孔 第一槽 凝胶下部切去一角 以标注凝胶的方位 8 染色 将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色1 2h 6 电泳将电泳装置与电源相接 凝胶上所加电压为8V cm 当染料前沿进入分离胶后 把电压提高到15V cm 继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm处 关闭电源 10 观察结果 SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中 待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度 9 脱色 染色完毕 倾出染色液 换脱色液脱色3 10h 其间需多次更换脱色液至背景清楚 观察你处理的血液样品离心后是否分层 见教科书图5 18 如果分层不明显 可能是洗涤次数少 未能除去血浆蛋白的原因 此外 离心速度过高和时间过长 会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀 也得不到纯净的红细胞 影响后续血红蛋白的提取纯度 三 实验结果分析与评价 1 你是否完成了对血液样品的处理 你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗 由于凝胶是一种半透明的介质 因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯 检查凝胶是否装填得均匀 此外 还可以加入大分子的有色物质 例如蓝色葡聚糖 2000或红色葡聚糖 观察色带移动的情况 如果色带均匀 狭窄 平整 说明凝胶色谱柱的性能良好 如果色谱柱出现纹路或是气泡 轻轻敲打柱体以消除气泡 消除不了时要重新装柱 2 你填装的凝胶色谱柱中是否有气泡产生 你的色谱柱装填得成功吗 你是如何判断的 如果凝胶色谱柱装填得很成功 分离操作也正确的话 能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀 狭窄 平整 随着洗脱液缓慢流出 如果红色区带歪曲 散乱 变宽 说明分离的效果不好 这与凝胶色谱柱的装填有关 3 你能观察到蛋白质的分离过程中 红色区带的移动吗 请描述红色区带的移动情况 并据此判断分离结果 练习1 凝胶色谱法也称为分配色谱法 它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一 所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体 这些小球体大多数是由多糖类化合物构成 小球体内部有许多贯穿的通道 当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时 各分子在色谱柱内进行两种不同的运动 即垂直向下的运动和无规则的扩散运动 相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部 只能分布在颗粒之间 通过的路程较短 移动速度较快 相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道 通过的路程较长 移动速度较慢 因此 样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出 相对分子质量中等的分子后流出 相对分子质量最小的分子最后流出 这种现象又叫分子筛现象 此外 凝胶本身具有三维网状结构 相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空