苏教版选修1 4.1 生物成分的分离与测定技术 课件（49张）.ppt

第四章生物化学与分子生物学技术实践第一节生物成分的分离与测定技术 蛋白质是由氨基酸组成的生物大分子 其理化性质一部分与氨基酸相同或相似 如两性电离 等电点 紫外吸收性质和呈色反应等 也有一部分又不同于氨基酸 如高分子量 胶体性质 沉淀 变性和凝固等特点 1 离心沉降法 原理 分子在溶液中能够运动和扩散 同时受重力场的作用还有沉降的趋势 分子越大 扩散越慢而沉降越快 分子越小 扩散越快而沉降越慢 甚至不能自然沉降 因此 借助离心力场 根据分子不同的大小 形状和质量在离心场中表现出不同的行为而达到相互分离的目的 一 蛋白质的分离与纯化 离心手段 离心机 离心机 按转速分 普通型离心机 500 4000r min 蛋白质分子质量大于108da 高速型离心机 8000 25000r min 蛋白质分子质量大于108da 超速型离心机 25000 80000r min 蛋白质分子质量在106 108da 超高速型离心机 150000r min 蛋白质分子质量在106 108da 蛋白质分子质量小于106者 用离心效果不好 应改用其他分离方法 离心机转数与离心力的换算 rpm revolutionperminute 离心机每分钟的转数 rcf relativecentrifugalfield 相对离心场 以重力加速度g的倍数来表示 rcf rpm r 以cm表示 离心机转轴中心与离心套管底部内壁的距离 rcf 1 119 10 5 r rpm 2 沉降速度法 差速离心 如果两种蛋白质的沉降系数相差一个数量级以上 可用差速离心 反复多次达到分离效果 原理 开始在一个较低的速度下离心 使沉降系数大的物质沉淀 其他物质仍保留在溶液中 取上清 在更大的离心场中再离心 又会获得一些沉淀物质 如此反复多次 便可使混合物逐级被分开 沉降平衡法 密度梯度离心 如果两种蛋白质的沉降系数相差不到一个数量级 用差速离心很难奏效 若改用密度梯度离心 便可获得比较满意的分离效果 原理 在离心管中造成一个梯度密度环境 使介质的最大密度大于分离物的最大密度 而后加入待分离物 在离心力的作用下 当分离物的密度与介质密度相等时 分离物即停留在与其密度相同的区域 从而达到分离目的 密度剃度离心时 离心管中的介质是不均一的 从近中心到远中心密度不断增加 形成梯度 常用的梯度介质有甘油 蔗糖 溴化钾 氯化铯 注意 选用介质要注意浮力密度范围 被分离的蛋白质密度不能大于介质的最大密度 所选介质不能影响蛋白质的活性 不腐蚀转头和离心管 价格要低廉 回收要方便等 二 透析法 原理 在透析过程中 大分子的蛋白质不能通过半透膜而滞留在透析袋内 小分子的物质可以自由进出透析袋 直到它在透析袋内外的浓度相同 即达到平衡 而使大分子与小分子分开 透析示意图 透析的动力是扩散压 它是由横跨膜两边的浓度梯度形成的 透析的速度与膜的厚度成反比 而与欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度及膜的面积和温度成正比 透析袋 透析膜可用纤维素 玻璃纸 火棉胶和动物膀胱等制成 透析膜的关键是膜孔的孔径 在选用透析膜时 最好选用截留分子质量远小于待分离蛋白质分子质量的透析膜 以免蛋白质丢失 透析袋的前处理和储存 透析袋的前处理 消除附着的重金属 蛋白水解酶和核酸酶 将透析袋放入0 5mol l的edta溶液中煮0 5hr 用水再煮几次 透析袋的储存 0 01 nan3 4 透析注意事项 透析时样品只能装至透析袋的一半 另一半挤瘪 不能留有空气 反之 渗透作用使袋内压力升高 可能使半透膜涨破或膜孔变形 导致蛋白质流失 透析液选用一定ph的缓冲液 温度保持在4 透析过程是个较慢的扩散过程 一般情况至少要10hr 甚至几天 为缩短透析时间 透析液要不断地搅拌并且勤换 透析的功能 分离纯化蛋白质 利用透析袋浓缩蛋白质稀溶液 透析液采用高浓度的高分子惰性物质 如peg4000等 膜内蛋白质浓度低 膜外高分子惰性物质浓度高 造成横跨膜的浓度梯度所形成的作用力 不仅使一部分小分子物质穿出透析膜 同时也使一部分水分子从膜内流向膜外 而膜外的大分子物质则不能穿过透析膜 因而便浓缩了蛋白质溶液 边做边学 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 一 实验目的 学习醋酸纤维薄膜电泳的操作了解电泳技术的一般原理 二 实验原理 任何一种物质的质点 由于其本身在溶液中的解离或由于其表面对其他带电质点的吸附 会在电场中向一定的电极移动 如氨基酸 蛋白质 酶 核酸等及其衍生物质都具有许多可解离的酸性或碱性基团 它们在溶液中会解离而带电 一般在碱性溶液中 即溶液的ph值大于等电点pi 分子带负电荷 在电场中向正极移动 而在酸性溶液中 分子带正电荷 在电场中向负极移动 移动的速度取决于带电的多少和分子的大小 泳动度 不同质点在同一电场中的泳动速度不同 常用泳动度或迁移率来表示 泳动度指带电质点在单位电场强度下的泳动速度 vd tdlu cm2 v 1 s 1 ev lvt 影响泳动度因素 带电质点的性质质点所带净电荷的量 质点的大小及质点的形状 一般说来质点所带净电荷越多 质点直径越小 越接近球形 则在电场中的泳动速度越快 反之则越慢 溶液的粘度电场强度溶液的ph值溶液的离子强度固体支持物的电渗现象 本实验用醋酸纤维薄膜 是纤维素的羟基乙酸化所形成的纤维纤维素醋酸酯 具有泡沫状的结构 厚度均为120um 有很强的渗透性 对分子移动阻力很小 三 器材与试剂 醋酸纤维薄膜2 8cm常压电泳仪点样器 用盖玻片代替 培养皿玻璃板粗滤纸电泳槽巴比妥缓冲液 ph8 6 离子强度0 07巴比妥2 76g 巴比妥钠15 45g 加水至1000ml 每个大组500ml 染色液每个大组200ml氨基黑10b0 25g 甲醇50ml 冰醋酸10ml 水40ml 可重复使用 漂洗液每个组100ml含甲醇或乙醇45ml 冰醋酸5ml 水50ml透明液每个组200ml含无水乙醇 冰醋酸 7 3 本实验不做定量不用配 四 操作方法 1 薄膜准备 用镊子取醋酸薄膜一张 放在绥冲液中浸泡20分钟 识别光泽面与无光泽面 并在有光泽面一角做记号 2 制造滤纸桥 剪取双层合适尺寸滤纸桥附在电泳槽支架上 使其一端与支架的前沿对齐 另一端浸入电极槽的缓冲液中 用缓冲液润湿并驱赶气泡 使滤纸紧贴在支架上 如图 3 点样 取出膜条 用双层滤纸吸干多余的液体 平铺在玻璃板上 无光泽面朝上 用点样器蘸取血清在膜条的一端1 5cm处 均匀划一条线 4 电泳 在两电极槽内加入等高的缓冲液 将膜条平悬于滤纸桥上 点样端靠近负极 盖严电泳室通电 电压120v 电流0 4 0 7ma cm膜宽 电泳60分钟 5 染色 电泳完毕后 取膜条放在染色液中浸泡10分钟左右 6 漂洗 漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止 可得色带清晰的图谱 保存 7 透明 将干燥的电泳图谱放入透明液中浸泡2 3分钟后取出贴于洁净的玻璃板上 干后放在两层滤纸中保存 8 计算 计算出每条蛋白的泳动度 注意事项 手尽量不要接触膜条 用点样器点样时不要点的太多 但也不能太少 线条均匀 用力水平 电泳槽放膜条支架上尽量不要有缓冲液 五 实验结果 六 结论与分析 思考题 1 用醋酸纤维薄膜做电泳支持物有什么优点 2 电泳图谱清晰的关键是什么 如何正确的操作 3 为什么要将点样一端放在电泳槽负极 4 根据人血清中蛋白各组分的等电点 估计它们在ph8 6的巴比妥电极缓冲液中电泳移动的相对位置 二 从生物材料中提取某些特定成分 几种芳香植物精油简介 柠檬精油取自柠檬果皮 具有消除紧张 焦虑 振奋精神的作用 可用于治疗神经衰弱 关节炎 还具有促进血液循环 杀菌止痛 平衡油脂分泌 舒缓肌肤老化 滋养头发的功效 茶树精油具有新鲜 强烈的药草香味 能改善毛孔阻塞 净化肌肤 抗感染 对治疗青春痘有奇效 它也能消除疲劳 缓解压力 天竺葵精油能收敛皮肤 平衡 调理 润滑中干性皮肤和敏感性皮肤 改善橘皮样表皮 还有助于恢复精力 平缓心情 茉莉精油能防止肌肤老化 对中干性皮肤和敏感性皮肤具有良好的保湿和滋润作用 尤其对女性的妊娠纹和内分泌有独特的改善效果 橙花精油具有清新的水果香味 不但能使人镇静 还能防止中干性肌肤的老化现象发生 给肌肤赋予青春活力 促进皮肤再生 橘油精油的提取 提取方法 实验装置 压榨法 压榨装置 实验原理 通过机械加压 压榨出果皮中的芳香油 实验步骤 橘皮的处理 在实验前一天 将新鲜橘皮用清水清洗沥干 石灰水浸泡 用ph大于12 质量分数为7 8 石灰水浸泡橘皮16 24h 清水漂洗 浸泡好的橘皮用流水彻底漂洗干净 沥干 粉碎和压榨 将橘皮粉碎 加入质量分数为0 25 的nahco3和质量分数为5 的na2s04溶液 并调节ph为7 8 用家用榨汁机或手动压榨机得到压榨液 过滤压榨液 将压榨液先用普通布袋过滤除去固体物和残渣 再用分液漏斗或吸管将上层的橘皮油分离出来 静置处理 将橘皮油在5 10 冰箱中静置5 7d 使杂质沉淀 分离出上层澄清橘皮油 再次过滤 将下层橘皮油用滤纸过滤 滤液与上层橘皮油合并 得到橘皮精油 分析 静置处理目的 分除去果蜡和水分 静置 漂洗 压榨 过滤 石灰水浸泡 再次过滤 橘皮油 石灰水 防止压榨时滑脱 提高出油率 降低压榨液黏稠度 过滤不堵塞筛眼 小苏打 硫酸钠 促进油和水的分离 用量分别为橘皮质量的0 25 和5 提取橘皮精油的实验流程示意图 课后练习 1 柑橘 柠檬芳香油的制备通常使用压榨法而不是水蒸馏法 是因为 水中蒸馏会导致原料焦糊b 柑橘 柠檬芳香油易溶于水会使芳香油的有效成分水解d a和c2 玫瑰精油提取的过程是 a 鲜玫瑰花 水 水蒸气蒸馏 油水混合物 分离油层 除水b 鲜玫瑰花 水 油水混合物 水蒸气蒸馏 分离油层 除水c 鲜玫瑰花 水 油水混合物 除水 分离油层d 鲜玫瑰花 水 油水混合物 水蒸气蒸馏 分离油层 除水 d a 3 在橘皮精油提取过程中石灰水的作用 使溶液呈碱性 为彻底清洗脏物 防止橘皮压榨时滑脱 提高出油率