CLSI微量稀释法.doc

最小抑菌浓度(MIC)测定 以肺炎链球菌 ATCC49619 为质控菌株，采用美国临床和实验室标准化委员会(CLSI)推荐的微量肉汤稀释法，MIC值参照国家临床实验室委员会2002年标准。抗菌药物稀释范围（毫克/毫升）：氨苄青霉素（116）、头孢噻呋（0.038）、环丙沙星（0.0154），红霉素（0.12516）、氟苯尼考（0.1232），青霉素（0.0158）、大观霉素（1256），四环素(0.0632)、泰妙菌素（0.2532）、替米考星（264）、甲氧苄啶和磺胺甲恶唑（0.0158）。每株菌液接种于含不同药物浓度的 96 孔微量板中，35 培养2024 h ，观察结果，同时以 ATCC27090 和ATCC25922 作为抗菌药物的敏感性试验质控菌株。1.5 最小抑菌浓度(MIC)测定 以肺炎链球菌 ATCC49619 为质控菌株，采用美国临床和实验室标准化委员会(CLSI)推荐的微量肉汤稀释法，检测临床上常用的19种抗生素对红斑丹毒丝菌安徽分离株的MIC。1.5.1 菌株活化 将红斑丹毒丝菌安徽分离株接种于3 mL BHI肉汤(含5% 犊牛血清)中，37 振荡(120 r/min)培养12 h，在对数生长期(600 nm吸光度为0.883)分别在BHI琼脂平板中传代两次，挑取单菌落划线接种到CAMHA上，培养18-24 h，再挑取单菌落接种于含5% 胎牛血清的CAMHB中，培养至浊度为0.5麦氏比浊单位，此时菌液浓度约为5108 CFU/mL，用CAMHB做1：1000稀释备用。1.5.2 抗菌药物储存液的制备 称取各种抗生素粉末，根据药物的理化性质及使用说明进行稀释配制，分别配制成终浓度为1280 g/mL的药物储存液，分装至1.5 mL EP管中，用封口膜封口后存至-80冰箱保存备用，可保存半年时间内不失活，避免反复冻融。1.5.3 MIC的测定 在96孔微量稀释板中连续倍比稀释药物储存液，药物初始浓度为128 g/mL，得到一系列100 L药物梯度稀释液(药物浓度范围为1280.0625 g/mL)，空白对照只加100 L培养基，阴性对照加菌悬液和培养基的混合物100 L。置于35温箱中培养24 h。在读取所测试菌株的MIC前，检查阴性对照管的细菌生长情况是否良好，同时检查空白对照是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。肉眼观察没有细菌生长的最低药物浓度即为该药物的MIC，每组试验重复三次。根据CLSI提供的人用抗生素的判定标准(M45-A2)进行结果判定6(表1)。表 1 MIC的判定标准Table 1 MICs criteria抗生素种类抗生素名称MIC(g/mL)肺炎链球菌ATCC49619范围Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 range敏感中敏耐药AntibioticsAntibiotics NamesensitiveSensitizedResistance青霉素类Penicillins青霉素（PEN）0.120.25240.251氨苄青霉素(AMP)0.250.5480.060.26头孢类Cephalosporins头孢曲松(CRO)1240.030.12头孢噻肟(CTX)1240.030.12头孢唑啉(CFZ)1232320.030.12大环内酯类Macrolides红霉素(ERY)0.250.510.030.12泰乐霉素泰(TYL)0.250.510.030.12喹诺酮类Quinolones环丙沙星(CIP)1240.251加替沙星(GAT)1240.0150.06氧氟沙星(OFX)12414恩诺沙星（ENR）0.250.5120.0150.06林克酰胺类Lincosamides克林霉素(CLI)0.250.5120.030.12林肯霉素(LIN)0.250.5120.030.12四环素类Tetracycline四环素(TET)48160.060.5强力霉素(DOX)48160.0150.12氨基糖苷类 Aminogly