苏教版选修1 第一章 第二节 分离特定的微生物并测定其数量 学案.doc

1.实验室中分离微生物的方法有平板分离法和选择培养分离，平板分离法常用的有涂布平板法和混合平板法。2针对某种微生物的特性，设计一个特定的环境，使之特别适合这种微生物的生长，而抑制其他微生物的生长。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离。3测定微生物数量的常用方法有涂布平板法和显微镜直接计数法。涂布平板法计数的结果与待测样品中真正的含菌数量相比往往偏低。4涂布平板法培养和计数微生物的流程为：准备实验器材采集土壤，制备悬液选择适于分离特定微生物的培养基接种培养与观察计数菌落。5涂布平板法计数微生物的公式：每克土壤样品的细菌数某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数稀释倍数(涂布所用稀释液为1 ml)第二节分离特定的微生物并测定其数量微生物的分离1分离原理在实验室中利用选择培养基可以筛选和分离出某种微生物，然后在高度稀释的条件下，在固体培养基上培养该微生物形成的单个菌落，即为纯培养物。2分离方法(1)平板分离法：包括涂布平板法和混合平板法。能将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面，每个孤立的活微生物体经过生长、繁殖均可形成单个菌落。(2)选择培养分离：科学家针对某种微生物的特性，设计一个特定的环境，使之特别适合这种微生物的生长，而抑制其他微生物的生长。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术，称为选择培养分离。(3)根据菌落特征初步分离：菌落的含义：是指单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。菌落特征：不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落一般都具有稳定的特征，如菌落的大小、形状、边缘特征、隆起程度、颜色等，这些可以成为对微生物进行分类、鉴定的重要依据。在选择培养分离微生物的过程中，“选择培养”的培养基按物理性质划分属于什么培养基？为什么？提示：固体培养基。便于选择、分离所需要的微生物。1涂布平板法与混合平板法的比较项目操作特点结果涂布平板法取一定稀释度的样品涂布平板用无菌玻璃刮铲将样品涂抹均匀先制作琼脂平板后加入菌液细菌菌落通常仅在平板表面生长混合平板法取一定稀释度的样品与熔化的琼脂混合将与样品混合后的琼脂倒入无菌培养皿菌液与琼脂混合，共同倒平板细菌菌落出现在平板表面及内部2.选择培养基的选择作用(1)原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。(2)方法：在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。改变培养基中的营养成分。 例如，缺乏氮源时可以分离固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物；用含无机碳源的培养基分离自养型微生物。改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物；用普通培养基在无氧条件下分离厌氧型和兼性厌氧型微生物。土壤微生物的分离、培养与数量测定1涂布平板法培养和计数土壤微生物(1)过程：(2)计数：每克土壤样品的细菌数某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数稀释倍数(涂布所用稀释液为1 ml)2显微镜直接计数法(1)原理：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。(2)血球计数板：血球计数板是一块特制的载玻片。其上有特定面积为1 mm2、高为0.1 mm的计数室，一个计数室又被分成25个(或16个)中方格，每个中方格再被划分成16个(或25个)小方格，每个计数室都由400个小方格组成。(3)操作过程：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，用无菌的毛细滴管吸取摇匀的土壤微生物悬液，在盖玻片的边缘滴一小滴，让菌液沿着缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室。加样后静止5 min，然后在显微镜下计数45个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按计算公式求出每毫升样品中所含的菌体总数。(4)计算公式：1 ml悬液所含菌体总数每小格平均菌体数400104稀释倍数。3分离土壤中能分解纤维素的微生物(1)实验目的：分离以纤维素为唯一碳源的微生物。(2)培养基配方特点：纤维素是唯一的碳源。(3)基本步骤：制备培养基制备土壤悬液接种培养观察。1阅读教材p19表11，并思考回答下列问题：(1)在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？琼脂的作用是什么？提示：碳源主要是葡萄糖，氮源是尿素。琼脂的作用是作为凝固剂。(2)该培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？提示：该培养基对微生物有选择作用。该培养基的氮源比较特殊，是尿素，只允许能以尿素作为氮源的微生物生长。(3)该培养基属于何种类型？提示：该培养基属于固体培养基，又属于选择培养基。2通过统计平板上的菌落数，获得的结果与实际活菌数相比，是偏高、偏低还是正好吻合？为什么？提示：偏低。一个菌落可能由两个或两个以上的细菌所形成。1直接计数法与间接计数法的比较微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等，但是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者比较如下：项目直接计数法间接计数法主要用具显微镜、细菌计数板培养基计数依据菌株本身培养基上菌落数优点计数方便、操作简单计数的是活菌缺点死菌、活菌都计算在内操作较复杂，且有一定误差计算公式每毫升原液含菌株数400104每小格平均菌株数稀释倍数每毫升原液含菌株数培养基上平均菌落数稀释倍数(涂布所用稀释液为1 ml)特别提醒(1)每次用移液管移取悬液前都要用洗耳球吹口对准移液管末端将悬液吸入或排出移液管数次，以使悬液均匀。(2)在涂抹平板操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。(3)每一稀释倍数菌液都至少要涂布3个平板，作为实验重复组，增强实验结果的说服力与准确性。选择菌落数为30300一组进行计数，并求平均值，若其中有菌落数与其他实验差距悬殊者，应舍弃该实验数据，不进行统计、计算。2土壤中能分解纤维素的微生物分离步骤(1)制备选择培养基：培养基中提供碳源的物质只有纤维素。(2)制备土壤稀释液：依次制备稀释度为101、102、103、104、105的土壤稀释液。(3)接种培养：分别吸取各稀释度的土壤稀释液1 ml转接到培养基中，每个稀释度重复3次，置培养箱中培养。(4)观察菌落的生成情况。 选择培养基的特点和应用例1下表是培养分解尿素的细菌的培养基配方，请回答下面的问题：编号成分含量kh2po41.4 gna2hpo42.1 gmgso47h2o0.2 g葡萄糖10.0 g尿素1.0 g琼脂15.0 g将上述物质溶解后，用自来水定容到1 000 ml(1)在该培养基的配方中，为微生物提供碳源的是_，提供氮源的是_。(2)绝大多数微生物都能利用_，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解_。(3)分析该培养基的配方，该培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？思路点拨精讲精析碳源是提供碳元素的物质，氮源是提供氮元素的物质，所以该培养基中碳源是葡萄糖，氮源是尿素。该培养基的配方中含有凝固剂琼脂，所以，配制的一定为固体培养基。绝大多数生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，所以这种培养基对微生物有选择作用。选择的原理是只有能够利用尿素的微生物才能够生长。答案(1)葡萄糖尿素(2)葡萄糖尿素(3)该培养基对微生物具有选择作用。以尿素为唯一氮源的培养基可以分离得到产生脲酶的微生物(即分解尿素的微生物)。微生物选择培养的原理(1)选择培养微生物的方法通常有两种：可利用该分离对象对某一营养物质有“嗜好”的原理，专门在培养基中加入该营养物质，从而使它成为一种加富培养基。可利用该分离对象对某种抑菌物质的抗性，在混合培养物中加入该抑菌物质，经培养后，其他微生物生长受抑制，而分离对象却可乘机大大增殖，在数量上占优势。(2)原则上只有目的微生物才能在选择培养基上生长。但实际上，微生物培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能够在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需要的微生物，还需要进一步的验证。分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是()加尿素不加尿素加琼脂不加琼脂加葡萄糖不加葡萄糖加硝酸盐不加硝酸盐abc d解析：选c要分离土壤中分解尿素的细菌，培养基中尿素应是唯一的氮源，不能加硝酸盐；在固体培养基上形成菌落，要加琼脂作凝固剂；分解尿素的细菌是异养生物，要加有机碳源(如葡萄糖)。以科研课题为载体，考查微生物分离与计数例2自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题：实验步骤：(1)制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。(2)选用_法接种样品。(3)适宜温度下培养。结果分析：(1)测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是()a一个平板，统计的菌落数是23b两个平板，统计的菌落数分别是22和26，取平均值24c三个平板，统计的菌落数分别是21、5和52，取平均值26d四个平板，统计的菌落数分别是21、30、24和25，取平均值25(2)一同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为23.4，那么每毫升样品中的菌株数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.2 ml)_。(3)用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量_，因为_。(4)某同学在测定大肠杆菌的密度时发现，在培养基上还有其他杂菌的菌落，能否肯定该大肠杆菌的品系被污染了？为什么？精讲精析实验步骤：(2)若要对大肠杆菌进行计数，常用涂抹平板法接种样品。结果分析：(1)在选取样品时，应选取多个菌落数相差不大的平板计数，取其平均值。(2)每毫升样品中菌株数稀释倍数即23.40.21061.17108。(3)由于菌落可能由1个或多个细菌连在一起生长而成的，所以实际活菌数量比测得数量多。(4)污染的原因可能是菌种不纯，也可能是培养基灭菌不彻底或接种过程操作不当。答案实验步骤：(2)涂布平板结果分析：(1)d(2)1.17108(3)多当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察的是一个菌落(4)不能。因为不能排除杂菌来自培养基或培养过程。本题出错原因是不理解菌落数目的统计规则。实验时，每一个浓度至少涂布三个平板，以增强实验的说服力和准确性。当样品的稀释倍数足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。计数时选择菌落数在30300的平板计数，若某两个或多个稀释浓度下获得的菌落数符合条件时，再看两者菌落数的比值：若小于2，则取两者的平均值；若大于2，则取小者。 课堂回扣练习1在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称作()a鉴别培养基b加富培养基c选择培养基 d基础培养基解析：选c鉴别培养基是在培养基中加入某种特殊化学物质，使微生物的代谢产物与特殊化学物质发生特定化学反应，产生明显特征变化以达到鉴别特定微生物的培养基；加富培养基一般用来培养营养要求比较苛刻的异养型微生物的培养基；基础培养基是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基，例如牛肉膏蛋白胨培养基；选择培养基是在培养基中加入特殊营养物质或化学物质，抑制不需要微生物的生长，有利于所需微生物生长的培养基。2下列关于微生物分离和培养的有关叙述，错误的是()a微生物培养前，需对培养基进行消毒b测定土壤样品中的细菌数目，常用菌落计数法c分离土壤中不同的微生物，要采用不同的稀释度d分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源解析：选a消毒不能杀死培养基上的所有微生物，所以在培养微生物前，应用高压蒸汽灭菌法对培养基进行彻底灭菌。3某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为215，那么每毫升样品中菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 ml)()a2.15108 b2.15109c215 d21.5解析：选b稀释倍数为106,0.1 ml稀释液的菌落数的平均值为215，则每毫升样品中菌落数就为2150.11062.15109。4用涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是()a平板上的一个菌落就是一个细菌b菌落中的细菌数是固定的c此时的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌d此方法统计的菌落数一定与活菌的实际数相同解析：选c当稀释倍数适宜时，培养基上的一个菌落可能来源于样品稀释液中的一个活菌，但也可能由2个或2个以上活菌生长而成，因此菌落数往往比活菌的实际数低。5(新课标全国卷)为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是_；然后，将1 ml水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 ml稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为_。(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过_灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。这样做的目的是_。(3)示意图a和b中，_表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中_的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高_的利用率。解析：(1)为了检测培养基平板灭菌是否合格，可在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间。(2)0.1 ml稀释液中平均有38个活菌，可推测每升水样中的活菌数38101001 0003.8107(个)。(3)接种环、接种针或其他金属用具直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌。在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，其目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。(3)比较两图可以看出，a是用平板划线法接种培养后得到的结果，b是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。(4)由于振荡培养可以提高培养液中溶解氧的含量，还可以使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率，因此振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。答案：(1)检测培养基平板灭菌是否合格3.8107(2)灼烧将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落(3)b(4)溶解氧营养物质 课下综合检测一、选择题1下列关于微生物分离的叙述，错误的是()a平板分离法能将单个微生物经过培养形成便于移植的菌落b只有细菌才可以形成菌落，所以只有分离细菌时才可能获得菌落c平板分离法有涂布平板法和混合平板法等d涂布平板法得到的菌落仅在平板的表面生长解析：选b大多数细菌、许多真菌和单细胞藻类均能在固体培养基上形成菌落。2有关涂布平板法的叙述错误的是()a首先将菌液进行一系列的梯度稀释b然后将不同稀释度的菌液分别涂抹到琼脂固体培养基的表面c适宜条件下培养d结果都可在培养基表面形成单个的菌落解析：选d涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，在适宜条件下培养的过程。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。3从土壤中分离能分解尿素的微生物与分离能分解纤维素的微生物时，所利用的培养基中最明显的特点是()a前者尿素是唯一的氮源，后者纤维素是唯一的碳源b二者都具有琼脂成分c二者的ph相同d以上均不正确解析：选a由于分离微生物所利用的是选择培养基，所以培养基中有与其他培养基不同的某种成分，该种成分是由培养的目的微生物而定的。分离能分解尿素的微生物，所利用的培养基中尿素是唯一的氮源，凡是能分解尿素的微生物就能生存，否则就不能生存。由相同的原理可知，分离能分解纤维素的微生物时，纤维素是唯一的碳源。4下列关于分离与培养土壤微生物的操作，叙述错误的是()a制备土壤悬液时，应依此配制成浓度分别为102、103、104、105、106、107、108 g/ml的土壤悬液b制平板时，应将熔化的培养基冷却到4550 后再倒入培养皿中，并迅速盖好培养皿盖c接种时应从最低的土壤悬液开始，并且每个浓度设置3个重复组d计数菌落时，应选取菌落数为100300的一组为代表进行统计解析：选d分离与培养土壤微生物的操作过程中，对土壤悬液应进行10倍浓度梯度差的稀释，并稀释至108g/ml。制平板时应防止杂菌的污染，接种时应从最低的土壤悬液开始，并且每个浓度设置3个重复组。计数时应选取菌落数为30300的一组为代表进行统计。5选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物，通过不含有机物的培养基、缺氮培养基、含尿素(不含其他氮源)的培养基，可从土壤中分离出的微生物依次是()a硝化细菌、放线菌、根瘤菌b根瘤菌、青霉菌、固氮菌c异养型细菌、放线菌、硝化细菌d自养型细菌、固氮菌、分解尿素的细菌解析：选d选择培养基是根据不同微生物的代谢特点，通过改变培养基的成分，以达到选择某种微生物的目的。不含有机物的培养基可以选择自养型微生物，缺少氮元素的培养基可以培养固氮微生物，含尿素(不含其他氮源)的培养基可以选择能分解尿素的微生物。6下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是()akh2po4、na2hpo4、mgso47h2o、葡萄糖、尿素、琼脂、蒸馏水bkh2po4、na2hpo4、mgso47h2o、葡萄糖、琼脂、蒸馏水ckh2po4、na2hpo4、mgso47h2o、尿素、琼脂、蒸馏水dkh2po4、na2hpo4、mgso47h2o、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、蒸馏水解析：选a在a项的培养基中既有尿素作为唯一氮源，又有其他各种成分，可以选择出分解尿素的细菌；而c项中缺少碳源，b项中无尿素作氮源，d项中有牛肉膏可提供氮源的成分。7用涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是()a涂布了一个平板，统计的菌落数是230b涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238c涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163d涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、240和256，取平均值235解析：选d在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，所以a、b两项不正确。c项虽涂布了3个平板，但是其中1个平板的计数结果与另两个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地用3个平板的计数值来求平均值。8下列说法中不正确的是()a科学家从7080 热泉中分离得到耐高温的taq dna聚合酶b统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为m1、m2、m3、m4、m5，以m3作为该样品菌落数的估计值c设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度d同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多解析：选btaq dna聚合酶是从一种水生耐热菌中分离提取的，这种耐热菌能在7080 的高温条件下生长。统计平板的菌落数时，应选择菌落数在30300的平板，每个稀释度至少取3个平板，为了提高准确度，应求其平均值。设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。土壤有“微生物的天然培养基”之称，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。二、非选择题9尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类、数量繁多，某生物小组试图探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌(目的菌)。培养基成分如下表所示，实验步骤如下图所示。请分析回答：kh2po4na2hpo4mgso47h2o葡萄糖尿素琼脂1.4 g2.1 g0.2 g10 g1 g15 g(1)培养基中加入尿素的目的是筛选_，这种培养基属于_培养基。(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的_和_，实验中需要振荡培养，目的是_。(3)转到固体培养基上时，常采用_法接种，获得单个菌落后继续筛选。(4)下列材料或用具中，需要灭菌的是_；需要消毒的是_(填序号)。培养细菌用的培养基与培养皿玻璃棒、试管、锥形瓶和吸管实验操作者的双手(5)在做分解尿素的细菌的分离与计数实验时，a同学从对应稀释倍数为106的培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只筛选出大约50个菌落。a同学的实验结果产生的原因可能有_(填序号)。土样不同培养基被污染操作失误没有设置对照解析：(1)培养基中加入尿素为唯一氮源能够筛选出能分解尿素的细菌，此培养基属于选择培养基。(2)尿素为“目的菌”提供氮源，葡萄糖为“目的菌”提供碳源。振荡培养基可溶入氧气，为培养的目的菌提供必需的氧气。(5)a同学比其他同学得到的实验结果数据大，可能是由于选取的土样不同，培养基灭菌不彻底或操作过程中受到杂菌污染，也可能是操作失误引起的，如稀释不够准确等。培养基上筛选出的细菌数量与是否设置对照无关。答案：(1)目的菌选择(2)尿素葡萄糖为目的菌提供氧气(3)涂布平