人细胞毒素相关蛋白A-(CagA)ELISA检测试剂盒实验操作说明书(科润达独家翻译).doc

人细胞毒素相关蛋白A （CagA）检测试剂盒（美国DRG 原装 货号 EIA 4138 96T）酶联检测人血清或血浆中抗CagA IgG抗体实验原理此试剂盒基于酶联免疫法，采用HRP酶联物；第一次孵育中，样本中的抗CagA IgG 抗体与包被的CagA 抗原结合，洗板除去未结合的，再次孵育，二抗（过氧化物酶标记的抗人IgG）与CagA-抗原-抗体复合物结合，再次洗板后，无色的显色剂（TMB）底物液加入微孔内，与过氧化物酶反应生成了有颜色的复合物，加入硫酸终止颜色反应，酶标仪450nm和405nm处检测颜色强度，标准品和样本中的抗CagA IgG 抗体浓度与颜色强度成正比试剂盒组成足够用于96人份的试剂试剂盒贮存于2-8各试剂有效期见试剂瓶标签试剂盒一旦开封，在2-8下可保存2个月1. 【MTP】包被板，96孔，包被有CagA抗原（重组DNA获得），未用的板条保存于密封袋内2-8下2. 【CAL】标准品，6瓶，1.5ml/瓶，抗CagA IgG 血清基质，浓度为0;15;30;60;120;240 RU/ml，即用，红色，叠氮化钠（0.1%）作为防腐剂3. 【CONJ】酶联物，1瓶，14ml，HRPO标记的小鼠单抗抗人IgG，TRIS 缓冲液，稳定剂，即用，粉色，新霉素作为防腐剂4. 【WASH】洗涤缓冲液（浓缩），1瓶，50ml，PBS-吐温20 ，硫柳汞（0.05%）作为防腐剂，使用前，用蒸馏水1:20比例稀释；若出现不溶解的晶体，则需在37下温育数分钟；稀释的洗涤液可在2-8下保存30天5. 【DIL】样本稀释液（浓缩，）1瓶，20ml，血清基质，稳定剂，红色，叠氮化钠（0.1%）作为防腐剂，使用前以稀释的洗涤液1:20比例稀释；稀释的样本稀释液2-8下可保存30天6. 【TMB】显色剂，2瓶，15ml，含柠檬酸-磷酸缓冲液，DMSO和H2O2的TMB，即用7. 【STOP】封闭液，1瓶，14ml，1N的硫酸，即用8. 【CPA】盖板9. 塑料包装袋实验所需材料但试剂盒未提供1. 带一次性枪头的可调的，自动的微量移液器2. 干燥箱，调节至3723. 用于试剂稀释的刻度容器4. 抽吸式泵或自动洗板设备5. 酶标仪（450nm和405nm）6. 坐标纸7. 蒸馏水此实验还可以用自动酶标仪进行操作样本采集与准备试验可检测血清或血浆样本适量的脂血样本不会影响结果，高含量的脂血或溶血样本可能会影响试验，纤维蛋白丝会干扰试验；确保检测前样本是清澈的，样本在2-8下可保存1周，想要保存更长时间建议冻存于-20，避免反复冻融使用前：以1:300的比例用先前已稀释的样本稀释液进行样本稀释 （如：10 ul 样本+ 2990 ul的稀释液）实验步骤试剂和样本平衡至室温使用前来回倒置混匀样本1. 准备的微孔：空白，标准品和样本2. 加100 ul 的标准品和先前稀释的样本于相应的微孔内 注意：标准品不用稀释3. 空白孔内加100 ul 的样本稀释液4. 用试剂盒内提供的胶粘纸张盖住包被板，372下孵育605 min5. 350 ul的稀释的洗涤液，洗板4次，吸走微孔内的所有液体6. 每孔加100 ul的酶联物7. 用试剂盒内提供的胶粘纸张盖住包被板，372下孵育302 min8. 按照步骤5）洗板9. 每孔加 100 ul的显色剂10. 372下孵育15 min，避免直射阳光11. 每孔加100 ul的封闭液12. 采用合适的酶标仪在50nm处读取吸收值，参考波长620nm（以空白对照孔校零），万一出现了吸收值溢出，则选择在405nm处读数；试验操作结束15min内必须完成读数（若采用的是自动酶标板设备，依据相关手册操作）实验操作图包被孔空白标准品样本试剂标准品-100 ul-稀释的样本-100 ul样本稀释液100 ul-孵育：372 ，605 min洗板：4 x 350 ul 酶联物100 ul100 ul100 ul孵育：372 ，302 min洗板：4 x 350 ul 显色剂100 ul 100 ul100 ul孵育：37 ，15 min 封闭液100 ul100 ul 100 ul读数：450 nm结果计算线性坐标纸上以标准品的浓度为X轴，吸收值为Y轴，绘制标准曲线；相应的抗-CagA IgG抗体浓度（RU/mL）根据各样本吸收值从标准曲线获得1. 样本IgG 值小于10 RU/mL，则判定为抗CagA IgG 抗体无反应2. 样本IgG 值10 -15 RU/mL，则判定为弱反应3. 样本IgG 值高于15 RU/mL，则判定为抗CagA IgG 抗体有反应计算示例以下数值仅供演示示例，不能用于代替实验数值通过标准曲线得到样本抗CagA IgG 抗体滴度为 70 RU/mL验证标准结果计算之前，先确保质控吸收值在以下期望值范围内描述期望值阴性质控0.100OD 值之比（标准品 240 RU/mL/标准品 15 RU/mL）2.5OD 值之比（标准品 15 RU/mL/标准品 0 RU/mL）3.5若数值不在期望值范围内，需重新实验本译文仅供参考，请以原说明书为准中国独家总代理：深圳市科润达生物工程有限公