人教版 选修一 血红蛋白的提取和分离课件（30张）.ppt

凝胶色谱法 分配色谱法 1 凝胶 2 概念 凝胶色谱法 分配色谱法 1 凝胶 一些微小多孔的球体 内含许多贯穿的通道 由多糖类构成如葡聚糖 琼脂糖 具多孔的凝胶就叫分子筛 2 概念 1 凝胶 一些微小多孔的球体 内含许多贯穿的通道 由多糖类构成如葡聚糖 琼脂糖 具多孔的凝胶就叫分子筛 2 概念 根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用 来进行分离 凝胶色谱法 分配色谱法 一 基础知识 凝胶色谱法分离蛋白质的原理 3 原理 当不同的蛋白质通过凝胶时 相对 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道 路程 移动速度 而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道 只能在 移动 路程 移动速度 相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离 相对分子质量较小 3 原理 当不同的蛋白质通过凝胶时 相对 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道 路程 移动速度 而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道 只能在 移动 路程 移动速度 相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离 较长 相对分子质量较小 3 原理 当不同的蛋白质通过凝胶时 相对 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道 路程 移动速度 而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道 只能在 移动 路程 移动速度 相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离 较长 较慢 相对分子质量较小 3 原理 当不同的蛋白质通过凝胶时 相对 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道 路程 移动速度 而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道 只能在 移动 路程 移动速度 相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离 较长 较慢 相对分子质量较大 相对分子质量较小 3 原理 当不同的蛋白质通过凝胶时 相对 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道 路程 移动速度 而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道 只能在 移动 路程 移动速度 相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离 较长 较慢 相对分子质量较大 凝胶外部 相对分子质量较小 3 原理 当不同的蛋白质通过凝胶时 相对 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道 路程 移动速度 而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道 只能在 移动 路程 移动速度 相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离 较长 较慢 相对分子质量较大 凝胶外部 较短 相对分子质量较小 3 原理 当不同的蛋白质通过凝胶时 相对 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道 路程 移动速度 而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道 只能在 移动 路程 移动速度 相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离 较长 较慢 相对分子质量较大 凝胶外部 较短 较快 相对分子质量较小 3 原理 当不同的蛋白质通过凝胶时 相对 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道 路程 移动速度 而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道 只能在 移动 路程 移动速度 相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离 4 具体过程 较长 较慢 相对分子质量较大 凝胶外部 较短 较快 相对分子质量较小 3 原理 当不同的蛋白质通过凝胶时 相对 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道 路程 移动速度 而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道 只能在 移动 路程 移动速度 相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离 缓冲溶液 1 概念 1 概念 在一定的范围内 能对抗外来少量强酸 强碱或稍加稀释不引起溶液ph发生明显变化的作用叫做缓冲作用 具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液 缓冲溶液 2 作用 能够抵制 对溶液的 的影响 维持ph基本不变 1 概念 在一定的范围内 能对抗外来少量强酸 强碱或稍加稀释不引起溶液ph发生明显变化的作用叫做缓冲作用 具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液 缓冲溶液 外界的酸或碱 2 作用 能够抵制 对溶液的 的影响 维持ph基本不变 1 概念 在一定的范围内 能对抗外来少量强酸 强碱或稍加稀释不引起溶液ph发生明显变化的作用叫做缓冲作用 具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液 缓冲溶液 外界的酸或碱 ph值 2 作用 能够抵制 对溶液的 的影响 维持ph基本不变 1 概念 在一定的范围内 能对抗外来少量强酸 强碱或稍加稀释不引起溶液ph发生明显变化的作用叫做缓冲作用 具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液 缓冲溶液 3 缓冲溶液的配制 通常由 种缓冲剂溶解于水中配制而成 调节缓冲剂的 就可以制得 使用的缓冲液 3 缓冲溶液的配制 通常由 种缓冲剂溶解于水中配制而成 调节缓冲剂的 就可以制得 使用的缓冲液 1 2 1 2 使用比例 3 缓冲溶液的配制 通常由 种缓冲剂溶解于水中配制而成 调节缓冲剂的 就可以制得 使用的缓冲液 1 2 使用比例 在不同ph范围内 3 缓冲溶液的配制 通常由 种缓冲剂溶解于水中配制而成 调节缓冲剂的 就可以制得 使用的缓冲液 说出人体血液中缓冲对 思考 nah2po4 na2hpo4 h2co3 nahco3 说出人体血液中缓冲对 思考 电泳 1 概念 1 概念 指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程 电泳 2 原理 许多重要的生物大分子 如 等都具有 在 下 这些基团会带上 在电场的作用下 这些带电分子会向着与其 移动 电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身 的不同使带电分子产生不同的 从而实现样品中各种分子的分离 多肽 核酸 2 原理 许多重要的生物大分子 如 等都具有 在 下 这些基团会带上 在电场的作用下 这些带电分子会向着与其 移动 电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身 的不同使带电分子产生不同的 从而实现样品中各种分子的分离 多肽 核酸 可解离的基团 2 原理 许多重要的生物大分子 如 等都具有 在 下 这些基团会带上 在电场的作用下 这些带电分子会向着与其 移动 电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身 的不同使带电分子产生不同的 从而实现样品中各种分子的分离 多肽 核酸 可解离的基团 一定的ph 2 原理 许多重要的生物大分子 如 等都具有 在 下 这些基团会带上 在电场的作用下 这些带电分子会向着与其 移动 电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身 的不同使带电分子产生不同的 从而实现样品中各种分子的分离 多肽 核酸 可解离的基团 正电或负电 一定的ph 2 原理 许多重要的生物大分子 如 等都具有 在 下 这些基团会带上 在电场的作用下 这些带电分子会向着与其 移动 电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身 的不同使带电分子产生不同的 从而实现样品中各种分子的分离 多肽 核酸 可解离的基团 正电或负电 所带电荷相反的电极 一定的ph 2 原理 许多重要的生物大分子 如 等都具有 在 下 这些基团会带上 在电场的作用下 这些带电分子会向着与其 移动 电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身 的不同使带电分子产生不同的 从而实现样品中各种分子的分离 多肽 核酸 可解离的基团 正电或负电 所带电荷相反的电极 带电性质的差异 一定的ph 2 原理 许多重要的生物大分子 如 等都具有 在 下 这些基团会带上 在电场的作用下 这些带电分子会向着与其 移动 电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身 的不同使带电分子产生不同的 从而实现样品中各种分子的分离 多肽 核酸 可解离的基团 正电或负电 所带电荷相反的电极 带电性质的差异 大小 一定的ph 2 原理 许多重要的生物大分子 如 等都具有 在 下 这些基团会带上 在电场的作用下 这些带电分子会向着与其 移动 电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身 的不同使带电分子产生不同的 从而实现样品中各种分子的分离 多肽 核酸 可解离的基团 正电或负电 所带电荷相反的电极 带电性质的差异 大小 一定的ph 2 原理 许多重要的生物大分子 如 等都具有 在 下 这些基团会带上 在电场的作用下 这些带电分子会向着与其 移动 电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身 的不同使带电分子产生不同的 从而实现样品中各种分子的分离 形状 多肽 核酸 可解离的基团 正电或负电 所带电荷相反的电极 带电性质的差异 大小 迁移速度 一定的ph 2 原理 许多重要的生物大分子 如 等都具有 在 下 这些基团会带上 在电场的作用下 这些带电分子会向着与其 移动 电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身 的不同使带电分子产生不同的 从而实现样品中各种分子的分离 形状 分类 分类 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶 是由单体丙烯酰胺和交联剂n n 亚甲基双丙烯酰胺在引发剂 过硫酸铵 和催化剂 四甲基已二胺 的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素 分类 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳 为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入 sds能使蛋白质发生完全变性 由几条肽链组成的蛋白质复合体在sds的作用下会解聚成单条肽链 因此测定的结果只是 sds能与各种蛋白质形成蛋白质 sds复合物 sds所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量 因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别 使电泳迁移率完全取决于 sds 为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入 sds能使蛋白质发生完全变性 由几条肽链组成的蛋白质复合体在sds的作用下会解聚成单条肽链 因此测定的结果只是 sds能与各种蛋白质形成蛋白质 sds复合物 sds所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量 因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别 使电泳迁移率完全取决于 sds 单条肽链的分子量 为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入 sds能使蛋白质发生完全变性 由几条肽链组成的蛋白质复合体在sds的作用下会解聚成单条肽链 因此测定的结果只是 sds能与各种蛋白质形成蛋白质 sds复合物 sds所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量 因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别 使电泳迁移率完全取决于 sds 分子的大小 为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入 sds能使蛋白质发生完全变性 由几条肽链组成的蛋白质复合体在sds的作用下会解聚成单条肽链 因此测定的结果只是 sds能与各种蛋白质形成蛋白质 sds复合物 sds所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量 因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别 使电泳迁移率完全取决于 单条肽链的分子量 测定 通常用十二烷基硫酸钠 sds 聚丙烯酰胺凝胶电泳 测定 通常用十二烷基硫酸钠 sds 聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白质相对分子质量 电泳检测pcr结果 琼脂糖凝胶电泳 电泳检测pcr结果 琼脂糖凝胶电泳 用鸡的红细胞提取dna 用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么 二 实验操作 鸡的红细胞具有细胞核 含有dna 便于进行dna的提取 人的红细胞无细胞核 结构简单 血红蛋白含量丰富 便于提取血红蛋白 用鸡的红细胞提取dna 用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么 蛋白质的提取和分离一般分为四步 1 样品处理 样品处理 粗分离 纯化 纯度鉴定 血液有哪些成分 血液 血浆 水分 其他物质 血浆蛋白 无机盐 磷脂 葡萄糖等 血细胞 白细胞 血小板 红细胞 最多 血红蛋白 90 两个 肽链 两个 一肽链 四个亚铁血红素基团 血液有哪些成分 血红蛋白 每个肽链环绕 此基团可携带 血红蛋白因含有 而呈红色 一个亚铁血红素基团 每个肽链环绕 此基团可携带 血红蛋白因含有 而呈红色 一个亚铁血红素基团 每个肽链环绕 此基团可携带 血红蛋白因含有 而呈红色 一分子氧或一分子co2 一个亚铁血红素基团 血红素 每个肽链环绕 此基团可携带 血红蛋白因含有 而呈红色 一分子氧或一分子co2 目的 去除 方法 离心 速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果 然后用胶头吸管吸出上层透明的 将下层 的红细胞液体倒入烧杯 再加入用 的 洗涤 1 红细胞的洗涤 杂质蛋白 目的 去除 方法 离心 速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果 然后用胶头吸管吸出上层透明的 将下层 的红细胞液体倒入烧杯 再加入用 的 洗涤 1 红细胞的洗涤 杂质蛋白 低速短时间 目的 去除 方法 离心 速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果 然后用胶头吸管吸出上层透明的 将下层 的红细胞液体倒入烧杯 再加入用 的 洗涤 1 红细胞的洗涤 杂质蛋白 低速短时间 黄色血浆 目的 去除 方法 离心 速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果 然后用胶头吸管吸出上层透明的 将下层 的红细胞液体倒入烧杯 再加入用 的 洗涤 1 红细胞的洗涤 杂质蛋白 低速短时间 黄色血浆 暗红色 目的 去除 方法 离心 速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果 然后用胶头吸管吸出上层透明的 将下层 的红细胞液体倒入烧杯 再加入用 的 洗涤 1 红细胞的洗涤 杂质蛋白 低速短时间 黄色血浆 暗红色 五倍体积 目的 去除 方法 离心 速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果 然后用胶头吸管吸出上层透明的 将下层 的红细胞液体倒入烧杯 再加入用 的 洗涤 1 红细胞的洗涤 杂质蛋白 低速短时间 黄色血浆 暗红色 五倍体积 生理盐水 目的 去除 方法 离心 速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果 然后用胶头吸管吸出上层透明的 将下层 的红细胞液体倒入烧杯 再加入用 的 洗涤 1 红细胞的洗涤 重复洗涤 次 直至上清液中已没有 表明洗涤干净 利于后续血红蛋白的分离纯化 不可洗涤次数过少 三 重复洗涤 次 直至上清液中已没有 表明洗涤干净 利于后续血红蛋白的分离纯化 不可洗涤次数过少 三 黄色 重复洗涤 次 直至上清液中已没有 表明洗涤干净 利于后续血红蛋白的分离纯化 不可洗涤次数过少 初次离心后的结果 初次离心后的结果 加 到 体积 再加40 体积的 溶解细胞膜 置于 上充分搅拌10分钟 加速细胞破裂 细胞破裂释放出血红蛋白 2 血红蛋白的释放 加 到 体积 再加40 体积的 溶解细胞膜 置于 上充分搅拌10分钟 加速细胞破裂 细胞破裂释放出血红蛋白 2 血红蛋白的释放 蒸馏水 加 到 体积 再加40 体积的 溶解细胞膜 置于 上充分搅拌10分钟 加速细胞破裂 细胞破裂释放出血红蛋白 2 血红蛋白的释放 原血液 蒸馏水 加 到 体积 再加40 体积的 溶解细胞膜 置于 上充分搅拌10分钟 加速细胞破裂 细胞破裂释放出血红蛋白 2 血红蛋白的释放 原血液 甲苯 蒸馏水 加 到 体积 再加40 体积的 溶解细胞膜 置于 上充分搅拌10分钟 加速细胞破裂 细胞破裂释放出血红蛋白 2 血红蛋白的释放 原血液 甲苯 磁力搅拌器 蒸馏水 将搅拌好混合液转移到离心管内 以2000r min的速度离心10min 试管中的溶液分为4层 3 分离血红蛋白溶液 有机溶剂无色透明的甲苯层 脂类物质白色脂溶性物质沉淀层 血红蛋白溶液红色透明液体 红细胞破碎物沉淀暗红色沉淀物 分离血红蛋白溶液 取 ml的血红蛋白溶液装入 中 将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol l的 中 ph为 透析12小时 目的是 或用于更换样品中的 透析袋一般用硝酸纤维素制成 又称玻璃纸 4 透析 1 取 ml的血红蛋白溶液装入 中 将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol l的 中 ph为 透析12小时 目的是 或用于更换样品中的 透析袋一般用硝酸纤维素制成 又称玻璃纸 4 透析 透析袋 1 取 ml的血红蛋白溶液装入 中 将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol l的 中 ph为 透析12小时 目的是 或用于更换样品中的 透析袋一般用硝酸纤维素制成 又称玻璃纸 4 透析 透析袋 磷酸缓冲液 1 取 ml的血红蛋白溶液装入 中 将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol l的 中 ph为 透析12小时 目的是 或用于更换样品中的 透析袋一般用硝酸纤维素制成 又称玻璃纸 4 透析 透析袋 磷酸缓冲液 7 0 1 取 ml的血红蛋白溶液装入 中 将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol l的 中 ph为 透析12小时 目的是 或用于更换样品中的 透析袋一般用硝酸纤维素制成 又称玻璃纸 4 透析 除去样品中分子量较小的杂质 透析袋 磷酸缓冲液 7 0 1 取 ml的血红蛋白溶液装入 中 将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol l的 中 ph为 透析12小时 目的是 或用于更换样品中的 透析袋一般用硝酸纤维素制成 又称玻璃纸 4 透析 除去样品中分子量较小的杂质 透析袋 磷酸缓冲液 7 0 缓冲液 1 取 ml的血红蛋白溶液装入 中 将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol l的 中 ph为 透析12小时 目的是 或用于更换样品中的 透析袋一般用硝酸纤维素制成 又称玻璃纸 4 透析 利用透析袋透析 2 凝胶色谱制作 1 凝胶色谱柱的制作 取长40厘米 内径1 6厘米的玻璃管 两端需用砂纸磨平 底塞的制作 底塞的制作 打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网 再用100目尼龙纱包好 顶塞的制作 组装 安装其他附属结构 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面 否则难以铺实尼龙网 还会导致液体残留 蛋白质分离不彻底 注意 2 凝胶色谱柱填料的处理 2 凝胶色谱柱填料的处理 2 凝胶色谱柱填料的处理 计算凝胶量 配置凝胶悬浮液 装填 洗涤平衡 凝胶装填时尽量紧密 以降低凝胶颗粒之间的空隙 装填凝胶柱时不能有气泡存在 因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序 降低分离效果 注意 缓冲液液面不要低于凝胶表面 否则可能有气泡混入 影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果 不能发生洗脱液流干 露出凝胶颗粒的现象 否则重新填装 注意 装配好的凝胶柱 在提取血红蛋白实验中用的缓冲液是什么 它的目的是什么 思考 在提取血红蛋白实验中用的缓冲液是什么 它的目的是什么 使用的是磷酸缓冲液 目的是利用缓冲液模拟细胞内的ph环境 保证血红蛋白的正常结构和功能 便于观察 红色 和材料的科学研究 思考 你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密 均匀吗 思考 如果凝胶装填得不够紧密 均匀 就会在色谱柱内形成无效的空隙 使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过 搅乱洗脱液的流动次序 影响分离的效果 你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密 均匀吗 思考 3 样品加入与洗脱 50cm高 3 样品加入与洗脱 缓冲液缓慢下降 50cm高 加透析样品 注意正确的加样操作 不要触及破坏凝胶面 贴壁加样 使吸管管口沿管壁环绕移动 注意 3 样品加入与洗脱 缓冲液缓慢下降 50cm高 样品渗入凝胶床 洗脱 收集 加透析样品 收集得到的纯化后的蛋白 1 你是否完成了对血液样品的处理 你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗 观察你处理的血液样品离心后是否分层 如果分层不明显 可能是洗涤次数少 未能除去血浆蛋白的原因 此外 离心速度过高和时间过长 会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀 也得不到纯净的红细胞 影响后续血红蛋白的提取纯度 1 你是否完成了对血液样品的处理 你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗 2 你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生 你的色谱柱装填得成功吗 你是如何判断的 2 你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生 你的色谱柱装填得成功吗 你是如何判断的 由于凝胶是一种半透明的介质 因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯 检查凝胶是否装填得均匀 此外 还可以加入大分子的有色物质 例如蓝色葡聚糖 2000或红色葡聚糖 观察色带移动的情况 如果色带均匀 狭窄 平整 说明凝胶色谱柱的性能良好 如果色谱柱出现纹路或是气泡 轻轻敲打柱体以消除气泡 消除不了时要重新装柱 3 你能观察到蛋白质的分离过程中 红色区带的移动吗 请描述红色区带的移动情况 并据此判断分离效果 如果凝胶色谱柱装填得很成功 分离操作也正确的话 能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀 狭窄 平整 随着洗脱液缓慢流出 如果红色区带歪曲 散乱 变宽 说明分离的效果不好 这与凝胶色谱柱的装填有关 3 你能观察到蛋白质的分离过程中 红色区带的移动吗 请描述红色区带的移动情况 并据此判断分离效果 1 在分离血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么 思考 让血红蛋白处在稳定的ph范围内 维持结构和功能 1 在分离血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么 思考 2 与其他真核细胞相比 红细胞有什么特点 这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义 思考 2 与其他真核细胞相比 红细胞有什么特点 这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义 血红蛋白是