食品酶学复习课件.doc

第三章 酶的生产、分离和纯化酶来自生物体，包括动物、植物和微生物。酶的生产：经过预先设计，通过人工操作控制而获得所需要酶的过程。酶生产的方法： 1、提取 2、化学合成 3、发酵法第一节 酶的发酵生产50年代后期酶生产的主要方法，指利用动植物细 胞或微生物细胞，主要是微生物细胞的生命活动而获得人们所需要的酶的过程，称为酶的发酵生产。1894年，日本人高峰让吉首次用米曲霉固体发酵生产淀粉酶作为消化剂。1917年，Boidin与Effront以枯草杆菌生产淀粉酶用于织物退浆。1947年，日本开始采用液体深层发酵生产a-淀粉酶。利用微生物发酵方法制取酶的优点是： 1）微生物种类繁多，酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多 样； 2）微生物生长繁殖快，发酵周期短，易提取酶，特别是胞外酶； 3）微生物培养简单，培养基来源广泛，价格便宜。 4）可采用微电脑等技术控制酶发酵生产过程，生产可连续化、自动化，经济效益高。 5）可利用以基因工程为主的现代分子生物学技术，选育新菌种、增加酶产率和开发新酶种。1、产酶菌的获得1）生产菌的要求u 安全可靠，不是致病菌，在系统发生上与病原体无关，也不产生毒素。FDA (Food and Drug Administration)鉴定、审核后认为可用于食品工业和医药工业的生产菌有：枯草杆菌（Bac. subtilis）、黑曲霉（Asp. niger）、米曲霉（Asp. oryzae）、啤酒酵母（Sac. cereusia）、脆壁酵母（Sac. fragieis）。u 不易变异退化、不易感染噬菌体，产酶稳定性好。u 产酶量高，酶的性质符合应用需要，最好是产胞外酶的菌株。u 能利用廉价原料，发酵周期短，容易培养。 产酶菌可从菌种保存机构如ATCC（American Type Culture Collection）和有关研究机构获得；一般都是通过筛选（screening）得到。筛选包括以下环节：菌样采集，菌种分离、纯化和生产性能鉴定。2）常见的产酶微生物细菌：枯草杆菌 淀粉酶 制糖、脱浆大肠杆菌 青霉素酰化酶 制备青霉素母核异型乳酸杆菌 葡萄糖异构酶 制果糖短小芽孢杆菌 碱性蛋白酶 皮革脱毛酵母：假丝酵母 脂肪酶 、尿酸酶等 乳品增香、绢丝脱脂等啤酒酵母 用于酿造啤酒、饮料酒和酒精等霉菌：黑曲霉 酸性蛋白酶 啤酒澄清、医药红曲霉 葡萄糖淀粉酶 制葡萄糖米曲霉 糖化酶和蛋白酶 制果糖青霉 葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酶、果胶酶等木霉 纤维素酶根霉 淀粉酶、酸性蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等毛霉 蛋白酶、糖化酶、果胶酶、凝乳酶等 3）菌样采集 为获得能够降解某种物质的产酶菌株，一般可从该物质比较丰富的地方寻找。相近菌种产生的酶在性质上一般相近或相似。 胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件一致；但胞内酶的热稳定性通常比菌的最适生长温度稍低。 4）菌种分离、纯化和生产性能的鉴定 产酶菌可采用平板划线法或直接稀释法分离纯化。 初筛多采用平板透明圈法。如筛选水解酶的生产菌，可以该酶的底物作为平板培养基的主要碳源或氮源，这样如果菌株包含所需要的酶，经过一段时间的培养后，就会在菌落的周围形成一透明的水解圈（clearing or lysis zone），从透明圈的大小可大致判断出菌株的产酶能力。5）产酶菌的筛选：主要依靠其催化的反应的性质、底物和产物的特异性等进行设计。 胞外酶筛选： 使待检测的微生物在含有酶作用的不溶性底物如淀粉、纤维素、酪素、细胞壁等作为培养基中生长，培养后，根据菌落周围产生的透明圈的大小可以晒选到产淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶和溶菌酶的高活性菌株。(平板透明圈法) 根据催化反应的产物的酸碱性，在培养基中加入底物和酸碱指示剂，培养后，依据产生酸或碱，依据菌落周围变色圈的大小和颜色深浅进行判断，从而进行产目标酶菌株的晒选。 设计特定的底物，使其在酶的作用下产生产物，产物遇底物有颜色的变化，菌落周围产生色圈，则可筛选到产酶的菌株。胞内酶筛选： 对于酶作用的底物分子质量较小，能透过细胞膜在细胞内发生反应，可以将其加在培养基中，根据菌落的颜色进行筛选。 对于大多数的胞内酶，是采用培养细胞或细胞破碎物作酶源，经酶反应后，根据酶反应产物的特点，利用产物对紫外的吸收，如辅酶NAD，直接用紫外分光光度法测定；或通过产物的显色反应等。2. 产酶菌的保存和培养 1）菌种的保存防止污染，尽量减少转移次数；避免对种子培养基进行长时间高热灭菌，以防对种子产生不良影响。 菌种保存的基本原理：通过采用低温、干燥与缺氧的条件，以中止菌种的繁殖，降低其新陈代谢，使之处于休眠状态。菌种保存的方法很多，常用的为斜面低温保存法，液体石蜡保存法等。有条件的还可采用冷冻真空干燥保存法。 2）菌种的活化和扩大培养 将保藏状态的菌种放入适宜的培养基中培养，逐级扩大培养以恢复菌种的活力，这就叫菌种活化。 为了发酵时有足够的菌种，活化了的菌种一般要经过一级至数级的扩大培养。3）培养方法 固体培养。又称表面培养（surface culture）、曲式培养，即以麸皮、米糠等为基本原料，再加入适量的无机盐和水分（通常50%左右）作为培养基进行的一种培养方式。设备简单，便于推广，特别适于霉菌类的培养，因为菌丝体在这种培养基中能较好地伸展、生长，产酶率高。如曲霉和毛霉生产淀粉酶和蛋白酶，青霉和曲霉生产果胶酶，木霉生产纤维素酶； 缺点是：物料利用不完全，劳动量大，易染菌，而且不适于胞内酶的生产液体培养。又称浸没式培养（submerged culture），采用液体培养基，在发酵罐内进行的一种搅拌通气式培养，是目前酶制剂和其它发酵产品的主要培养方式。 液体发酵需要一定的设备和技术条件，动力消耗也较大，但原料利用率和产量都较高，而且培养条件容易控制。3）培养条件 培养基的组成：u 碳源。不宜使用葡萄糖等易被利用的碳源为培养基，也不宜提供太丰富的碳源营养。某些碳源是酶的诱导物，定向地促进某些酶地合成，如淀粉可诱导淀粉酶的合成。u 氮源。氮源是菌体蛋白质和核酸的原料。各种微生物对氮源的利用情况相当复杂，有的喜欢无机氮，有的喜欢有机氮，氮源的性质，使用的浓度都能对菌的生长和酶的形成带来不同程度的影响。u 碳氮比。在某些情况下，对菌的生长和产酶也有直接关系。u 无机盐。这些离子直接参与细胞物质的组成，或者作为酶的活性组成部分与活化剂发挥作用。u 生长因子。一些微量有机物质，主要是B族维生素。它们对微生物的代谢起调节作用，有时作为辅酶的构成部分，影响酶的活性。在玉米浆、酵母膏和麦芽浸液等天然物质中通常含有这些生长因子，不需要另外添加。u 产酶促进剂。指在培养基中添加某种少量物质,能显著提高酶的产率,这类物质称为产酶促进剂。 通常有两种:一种是诱导物，可以是底物、产物或底物类似物。如纤维二糖诱导纤维素酶。 另一种是表面活性剂，如吐温-80的浓度为0.1%时能增加许多酶的产量,增加细胞的通透性，改善氧的传递速度,还可保护酶的活性 影响菌种产酶的因素： 培养温度。产酶菌生长繁殖和产酶的最适温度往往不一致。培养温度也可能直接影响酶合成后的稳定性，特别是酶的耐热性。如：55下培养形成的-淀粉酶的热稳定性比35培养的高许多。 pH。培养基的酸碱度对产酶影响很大。相当多的水解酶，产酶的最适pH与酶作用的最适pH相近；有些水解酶和氧化酶则相距甚远。很多微生物能同时产生几种相关的酶，改变培养基的pH，可能影响到各种酶的合成比例。u 通气量。大多数产酶菌是好气菌，因此调节通气量对提高酶产量往往有直接意义。采用液体深层发酵时，较小的通气量有利于霉菌的孢子萌发和菌体生长。而较大的通气量则常可促进酶的形成。固体发酵时，菌体生长通常要求通以空气，而较小的通气量却能显著提高酶的产量。u 湿度。对于固体发酵比较重要，它直接影响产酶率，也与产酶达到高峰的时间有关。第二节 提高酶发酵产量的方法1、酶的合成调控机制 酶和其它蛋白质一样，它的合成可在复制（replication）、转录（transcription）和翻译（translation）等各种水平上进行调节控制。原核生物的转录调节机制现在普遍接受的是操纵子模型。这是通过调节酶的合成来调控。 另外可通过抑制酶的活性来调控。细胞所生产的物质的合成有两个负的调节系统，即通过抑制酶的活性和阻遏酶的合成来调节。1）诱导酶合成的调节 (添加诱导物提高酶产量)适用于可诱导的酶类，食品工业应用的酶如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、乳糖酶等均属于诱导酶。在酶合成时最好的诱导物为该酶的作用底物或其结构类似物。 加入诱导物后，通常要经过一个极短暂的潜伏期(例如几分钟)，诱导才会出现，除去诱导物后，诱导立即停止。 2）酶合成的反馈阻遏 (通过降低阻遏物浓度提高酶产量) 反馈阻遏是指酶作用的终产物对酶合成产生的阻遏作用，引起反馈阻遏的终产物往往是小分子物质，也称为共阻遏物。 调节基因产生立体阻遏物，当终产物或共阻遏物存在时，两者相互结合并与操纵基因结合，RNA聚合酶不起作用，使操纵基因关闭，酶合成受到反馈抑制。若解除阻遏物即无终产物, RNA聚合酶起作用，使操纵基因开启，酶合成继续.3）分解代谢对酶合成的阻遏作用 分解代谢阻遏作用（或称为葡萄糖效应）是指培养基中由于葡糖糖的存在微生物虽然能迅速生长，但明显抑某些分解代谢诱导酶的形成。 葡萄糖的存在影响细胞内环腺苷酸（cAMP）的产生，cAMP是启动RNA聚合酶作用中不可缺少的辅助因子，cAMP的缺少导致对分解代谢的酶形成阻遏作用。 4）酶合成的细胞膜透性调节 调节胞外酶的分泌 主动运输的调节（透性酶或表面酶） 间隔作用调节（酶的催化速率受到亚细胞器结构的影响）2、通过发酵条件的控制提高酶产量 菌种产酶性能是决定发酵效果的重要条件。为了提高酶产量，需对发酵过程的参数进行优化。(1)通过控制pH来提高酶产量(2)通过控制温度来提高酶产量(3)通过中间补料提高酶产量(4)通过溶解氧来提高酶产量溶氧速率的调节方法：调节通气量调节氧分压调节气液接触时间和面积3、通过基因突变提高酶产量基因突变（gene mutation）可发生在结构基因上，也可发生在操纵子其它部位上。前者往往导致酶的结构和性质改变，而后者则通常引起酶产量升高或降低。基因突变可自发地发生，即自然育种，但机率很小，故在实际工作中需采用某些方法进行诱变，即诱变育种：物理方法：紫外线、-射线（Co-60）及快中子辐射等。直接引起核酸分子中四种脱氧核苷酸，特别是C、T发生变化，造成DNA损伤和畸变。化学方法：5-溴尿嘧啶等，通过代谢渗入到DNA中引起突变；亚硝胍等，直接和DNA中地A、C、G等反应而导致异变；口丫啶黄染料等，能引起DNA链中核苷酸的插入或缺失而造成移码突变。生物诱变剂：噬菌体用来进行诱变的出发菌株选择时应注意以下几点：（1）有一定的目标产物的生产能力（2）对诱变剂敏感的菌株变异幅度大（3）生产性能好的菌株（4）可选择已经诱变后的菌株筛选的目的（1）高产菌株的筛选（2）抗分解代谢阻遏突变株的筛选（3）无孢子突变株的筛选（4）药物抗性突变株的筛选4、通过基因重组提高酶产量体内基因重组（gene recombination），包括通过接合、转导、转化等方法进行的少数或者个别基因的重组；也包括通过原生质融合进行的整个染色体的重组。如：质粒（plasmid）整合、噬菌体转导（phage transduction）、转化、原生质融合（protoplast fusion）。体外基因重组（gene recombination in vitro），简称DNA重组技术（recombinatant DNA technique），或基因工程（ gene engineering）。它是利用酶学方法将外源基因与载体DNA在体外进行重组，然后将形成的重组子转化到受体细胞，使所需要的外源基因在受体细胞中复制表达，从而达到改造生物遗传特性目的的一种技术与方法。5、其他提高酶产量的方法（改变碳氮比，添加产酶促进剂等）添加表面活性剂。表面活性剂，特别对胞外酶来说，可能因为能增大细胞膜的通透性，从而提高酶产量。常用的表面活性剂有:Tween 80、Triton X-100(聚氧乙烯异辛基苯基醚) 、油酸等。或是酶的诱导物。食品常用酶发酵生产举例：-淀粉酶的生产 枯草杆菌糖化酶的生产 黑曲霉蛋白酶的生产 米曲霉、地衣芽孢杆菌脂肪酶的生产 假丝酵母果胶酶的生产 臭曲霉固态法第三节 酶的分离纯化方法酶分离纯化的基本原则： 1）防止酶失活（denaturation-deactivation），操作必须在低温下进行，避免过酸过碱，重金属能使酶失效，有机溶剂能使酶变性，微生物污染以及蛋白质水解酶的存在能使酶分解破坏； 2）选择有效的纯化方法； 3）酶活力测定贯穿纯化过程的始终1.酶的抽提1)预处理与细胞破碎提取酶前，通常对原材料进行适当的预处理（pretreatmention）。例如：动物材料要先剔除结缔组织、脂肪组织；油质种子最好先用乙醚等脱脂；种子研磨前应去壳；微生物材料应将菌体和发酵介质分离；部分酚类物质含量高的材料如茶鲜叶在细胞破碎的同时应避免多酚吸附蛋白质。动植物材料先要进行细胞破碎（cell disruption），一般采用匀浆器（homogenizer）或加砂研磨。许多材料研磨后可先制成丙酮粉（acetone powder）。材料粉碎后，低温下加入510倍预冷的丙酮，搅拌均匀后过滤，低温干燥。丙酮处理一方面能有效地破坏细胞壁（膜），有利于除去大量脂质，使某些与膜结合的酶易于溶解，此外丙酮粉含水量低，便于保存。但有些酶不能采用此法。细胞破碎的方法：(1) 机械(匀浆)法(2) 超声波法(3) 冻融法(4) 渗透压法(5) 酶消化法(6) 化学破碎法（有机溶剂处理和表面活性剂处理 riton、Tween）2)抽提方法大多数酶属于球蛋白类，一般都溶于稀盐、稀酸或稀碱的水溶液。抽提液的选择要考虑酶的溶解性、稳定性以及如何最有利于切断酶和其他物质的联系。选择的pH不能超出酶的稳定范围，远离目的酶的等电点。大多数蛋白质在低浓度的盐溶液中有较大的溶解度，所以一般采用等渗盐溶液。抽提温度多控制在0-4左右。根据酶抽提时采用的溶剂或溶液的不同, 酶的提取方法有以下几种: (1) 盐溶液提取 (2) 酸溶液提取 (3) 碱溶液提取 (4) 有机溶剂提取(1) 盐溶液提取大多数酶溶于水, 而且在一定浓度的盐存在的条件下, 酶的溶解度增加, 这称之为盐溶现象,但是盐浓度不能太高,否则溶解度反而降低, 出现盐析现象。一般采用稀盐溶液进行酶的提取，盐浓度一般控制在0.020.5mol/L的范围内。(2) 酸溶液提取有些酶在酸性条件下溶解度较大而且稳定性好，这种酶宜用酸溶液提取。(3) 碱溶液提取有些酶在碱性条件下溶解度较大且稳定性较好，应采用碱溶液提取。(4) 有机溶剂提取有些与脂质结合比较牢固或分子中含非极性基团较多的酶,不溶或难溶于水、稀酸、稀碱和稀盐溶液中，需用有机溶剂提取。常用的有机溶剂是与水能够混溶的乙醇、丙酮、丁醇等。 3)浓缩 浓缩（concentration）一方面减少纯化操作容积 ，同时酶的稳定性也能提高。工业上可用真空减压浓缩、薄膜浓缩、冷冻浓缩和逆向渗透作用进行浓缩。 对于少量酶液下述方法浓缩更合适： 超过滤浓缩（ultrafiltration）；凝胶浓缩；聚乙二醇浓缩法。2. 酶的纯化原理与方法 1）根据溶解度的不同，有盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法及选择性沉淀法和等电点沉淀法等。 2）根据分子大小的差别，有凝胶过滤（层析）法、筛膜分离法和离心法等。 3）根据分子的解离性质和所带正负电荷的种类及量的不同，有吸附（层析）法、离子交换层析法、电泳法以及聚焦层析法。 4）基于酶和底物、辅助因子以及抑制剂间具有专一亲和作用的特点而建立的各种亲和分离法等。5）利用稳定性差别而建立的的分离方法有选择性热变性法、酸碱变性法和表面变性法等。 6）色谱法。 7）结晶。在酶蛋白质提纯过程中，当酶的纯度达到一定浓度就可以进行酶蛋白质的结晶。现在，对蛋白质结晶的兴趣主要在于制备适合于X-射线衍射研究、中子衍射研究的晶体。适用于这种研究的单晶（最小晶体），其线性大小至少在0.2毫米以上。要培养出这样的单晶，必须寻找适宜的结晶条件。常用的分离方法(1) 沉淀法: 盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、非离子型聚合物沉淀法、聚电解质沉淀法和高价离子沉淀法等。(2) 凝胶过滤(3) 亲和层析(4) 染料层析(5) 疏水层析(6) 电泳法(1) 沉淀法沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法。但目前仍然广泛应用在工业上和实验室中。沉淀法由于成本底、收率高，因而通常作为初步分离的一种手段。根据所加入的沉淀剂的不同, 沉淀法又分为: 盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、非离子型聚合物（PEG)沉淀法、聚电解质沉淀法和高价离子沉淀法等。(2) 凝胶过滤(gel filtration chromatography)凝胶过滤又称凝胶层析、凝胶排阻层析、分子筛层析等，它是根据溶质分子的大小进行分离的方法。在酶纯化中占有重要位置。 优点：操作方便、物质不变性、可反复使用等。 应用：脱盐、生物大分子按分子的大小分级分离以及分子量的测定。凝胶的种类1、葡聚糖凝胶 白色粉末, 不溶于水和盐溶液,因具有大量羟基, 亲水性大,在水中即显膨胀, 它对弱酸和弱碱稳定, 其商品名是Sephadex G-X。G-后的数字表示每克干胶吸水量的10倍。2、聚丙烯酰胺凝胶 以丙烯酰胺为单体，通过交联剂共聚而成的凝胶物质，其商品名是 Bio-Gel P-X， P-后的数字乘以1000表示其分离的最大分子量。3、琼脂糖凝胶 琼脂糖是琼脂抽去琼脂胶之后所得半乳糖自动缔合而 成的网眼结构物质, 孔径大小由胶的浓度决定。有商品Sepharose 2B、4B、6B等规格, Sepharose CL, Bio-Gel A。凝胶层析的操作1. 凝胶的选择2. 装柱3. 加样4. 洗脱5. 凝胶的再生和保养(4) 染料层析：用染料做亲和配基，这些染料结构中都含有三嗪环。(5) 疏水层析：将疏水性基团固定到介质上，这些基团与蛋白质生物大分子上的疏水区亲和。同一疏水基团对不同蛋白质的亲和力存在差异，从而达到分离的效果。(6) 电泳法: 是靠溶质在电场中移动速度不同而分离的方法。 在电泳中，常伴有电渗现象。 在电场中，液体相对于一个固定固体的相对移动，称为电渗。3. 酶分离、纯化的评价酶纯化收支表步骤 酶活力 蛋白浓度 总体积 总活力 总蛋白 比活力 产量 纯化倍数 （U/ml） (mg/ml) (ml) (U) (mg) (U/mg) (%) 一般用电泳法检测酶的纯度。SOD酶纯化过程新鲜动物血 分离红血球 生理盐水洗涤 破裂红细胞 有机溶剂 萃取 沉淀 热变形 盐析 过离子交换树脂柱 透析 冷冻干燥 酶制剂 4. 酶分子量的测定一般采用超离心沉降速度、凝胶层析和聚丙烯酰胺凝胶电泳方法和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF）测定酶的分子量。5. 酶的剂型与保存酶制剂常以四种剂型供应：u 液体酶制剂。在除去菌体后不再纯化而直接制成或加以浓缩，比较经济，但不稳定，而且成分复杂。u 固体酶制剂。发酵液经过杀菌后直接浓缩干燥制成，有的则加有淀粉等填充料。u 纯酶制剂。包括结晶酶在内，通常用作分析试剂或用作医疗药物，要求有较高的纯度。u 固定化酶制剂。是借助物理方法或化学方法将酶固定于水不溶性或者水溶性载体而制成的一种酶制剂形式。影响酶保存期的因素(1) 温度:在低温条件下(04)使用、处理和保存。(2) pH值: pH应在酶的pH稳定范围内，采用缓冲液保存。(3) 酶蛋白的浓度: 一般酶浓度高较稳定,低浓度时易于解离、吸附或表面发生变性失效。(4) 氧: 有些酶易于氧化而失活。(5) 为提高酶的稳定性常加入稳定剂。（底物、抑制剂和辅酶；对巯基有保护作用的保护剂；Ca2+ 保护淀粉酶；Mn2 +保护溶菌酶）共价调节酶共价调节酶（covalent regulatory enzyme） 是一类由其它酶对其结构进行可逆共价修饰，使其处于活性和非活性的互变状态，从而调节酶活性。共价调节酶一般都存在相对无活性和有活性两种形式，两种形式之间互变的正、逆向反应由不同的酶催化。磷酸化是可逆共价修饰中最常见的类型。蛋白激酶的调节作用能被催化水解磷酸基团的蛋白质磷酸酶逆转。通过磷酸化和脱磷酸化作用，使酶在活性形式和非活性形式之间互变。此外还有腺苷酸化 / 脱腺苷酸化、甲基化 / 脱甲基化，乙酰基化 / 脱乙酰基化等。抗体酶 (Abzyme)具催化能力的免疫球蛋白称为抗体酶或催化抗体。通过改变抗体中与抗原结合的微环境，并在适当的部位引入相应的催化基团，所产生的具有催化活性的抗体。由两种途径获得抗体酶：采用过渡态的底物类似物诱导； 在现有的抗体基础上，通过化学修饰或通过蛋白质工程向其配体结合部位导入催化基团。1986年Pollack, S. J.等人报道了具有催化活性的抗体，被认为抗体酶。抗体酶具有典型的酶反应特性；抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动力学及pH依赖性等。第四章 酶的稳定性和固定化第一节 酶的稳定性的分子原因 酶的稳定性是指酶抵抗各种因素的影响，保持其活性的能力。 酶的催化活性是由其特殊的空间结构决定的。稳定的酶的空间结构是由稳定酶空间结构的力决定的。稳定蛋白质构象的力： 盐键、氢键和范德华力 蛋白质中盐键的数目较少，但因为它能维持二级结构，对蛋白质的稳定性作用显著。 二硫键、酯键蛋白质分子内形成二硫键，使伸展蛋白质的熵急剧降低，因而天然蛋白质和变性蛋白质的自由能间的差别增加。 疏水作用 带有非极性侧链的氨基酸大约占蛋白质分子总体积的一半，蛋白质的非极性部分总是趋向于使其不与水接触，并尽可能地隐藏在蛋白质的内部。这种疏水作用使蛋白质稳定性增加。酶稳定的分子原因： 稳定蛋白质构象的力(盐键、氢键、二硫键、酯键、范德华力和疏水作用)。 u 金属离子、底物、辅助因子和其他低相对分子量配体和酶相互作用使酶蛋白构象稳定。 金属离子由于结合到多肽链的不稳定部分（特别是拐弯处），可以显著增加酶的稳定性。u 酶蛋白质与其它的生物大分子尤其是蛋白质与脂的作用。 在生物体内，蛋白质常与脂类或多糖相互作用形成复合物，屏蔽了蛋白质表面的疏水区域，从而显著增加蛋白质的稳定性。u 氨基酸残基的坚实装配 蛋白质分子中存在约25%的体积的空隙，这些空隙通常为水分子所充满。由布朗运动调节的极性水分子与蛋白质疏水核的接触会导致蛋白质不稳定。u 对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低 活性部位的氨基酸残基的氧化作用是酶失活的最常见机理之一。如半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚环，对氧化特别敏感。第二节 酶失活的原因和机理u 蛋白质水解酶作用 微生物和外源蛋白水解酶作用催化肽键水解。由基因工程菌纯化真核细胞多肽时收率低，是由于体外蛋白水解造成的。u 聚合作用 聚合作用首先使包埋的疏水性氨基酸残基暴露于水溶剂，导致蛋白质可逆变性；其次，蛋白质分子彼此缔合，以减少疏水氨基酸的不利裸露；最后，如果蛋白质分子含有半胱氨酸和胱氨酸残基，则会发生分子间二硫键交换反应。聚合作用有时可通过还原和再氧化再生天然二硫键，使蛋白质再活化。聚合和简单沉淀是有区别的，后者并未使蛋白质发生显著的构象变化。u 极端pH 极端pH条件下，一旦远离蛋白质的等电点，蛋白质分子内相同相同电荷间的静电斥力会导致蛋白质伸展，埋藏在蛋白质内部的非电离残基会电离，这些构象变化能导致不可逆失活。另外，强酸条件下或中等pH和高温相结合的条件下，肽键容易发生水解。 如:碱催化的-消除反应可破坏蛋白质的二硫键。u 氧化作用各种氧化剂能氧化带芳香族侧链的氨基酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基。常见的蛋白质氧化剂：分子氧、过氧水和氧自由基。u 表面活性剂(去污剂)阴离子去污剂如十二烷基硫酸钠（SDS）与蛋白质结合时导致蛋白质伸展，使原先埋藏的疏水氨基酸暴露，有利于SDS的进一步结合，直至达到饱和为止，SDS聚集在蛋白质暴露的疏水区域周围。对于所有蛋白质来说，每克蛋白质结合SDS的最大量类似，大约1.4g/g。阳离子去污剂也能结合蛋白质，而它的临界胶束浓度（CMC）是SDS的10倍，因而，蛋白质更能抵抗阳离子去污剂的变性作用。 非离子去污剂如Triton X-100通常不能使蛋白质变性。变性剂（脲和盐酸胍、高浓度盐、螯合剂、有机溶剂）u 重金属离子和巯基试剂重金属阳离子如Hg2+、Cd2+、Pb2+能与蛋白质的巯基反应（将其转化为硫醇盐），也能与组氨酸和色氨酸残基反应。 此外银或汞能催化水解二硫键。 巯基试剂通过还原二硫键也能使酶失活，但通常是可逆的。u 热 热失活是最常见的蛋白质失活方式。酶可逆伸展使它的反应基团和疏水区域暴露，随后相互作用导致不可逆失活。u 机械力 机械力（压力、剪切力、振动）和超声波能使蛋白质变性。u 冷冻和脱水低温减弱了疏水相互作用，引起蛋白质的解离和变性。冷冻过程中，蛋白质随着水分子结晶而被浓缩，引起酶微环境中的pH和离子强度的剧烈变化，从而引起寡聚蛋白质的解离。还有一原因是二硫键交换和巯基氧化。酶的失水和冷冻是相似的。u 辐射作用电离辐射（如X射线、射线、电子、粒子）由于形成自由基引起蛋白质一级结构的改变，导致天然构象丧失或聚合。 非电离辐射，如可见光或紫外线辐射也能使蛋白质失活。它能吸收光，然后氧化蛋白质分子中的敏感基团（半胱氨酸、色氨酸、组氨酸）。第三节 酶的稳定化一、固定化酶固定到载体上后产生空间障碍，其他大分子难以与酶作用。固定化后，载体阻挡酶不能与失活剂结合，因而能抑制化学失活。在固定化系统中，氧向酶的扩散可被多价电解质支持物的盐析效应所遏止，因此可稳定对氧不稳定的酶蛋白。酶包埋在多孔颗粒内部，一方面使酶的构象更加坚固，从而阻止酶构象从折叠态向伸展态过渡, 抑制酶的自降解；另一方面，对底物的扩散抑制可明显使固定化酶稳定化。固定化酶由于微环境的改变，其最适pH、底物专一性和动力学常数会发生改变。二、非共价修饰反相胶束是由两性化合物在占优势的有机相中形成的，它可以包埋酶或使酶微囊化，使酶在不利的环境下起作用。许多化合物可增加溶液酶或冻干过程中酶的稳定性。这类添加剂分为3类：专一性的底物和配体；非专一性的中性盐和多羟基化合物；与酶失活剂竞争的物质如蛋白质、螯合剂、还原剂。 蛋白质间非共价相连,由于从蛋白质表面相互作用区域排除水，因而降低自由能，增加蛋白质的稳定性。酶的聚合体的活力和稳定性也常比其单体高。三、化学修饰可溶性大分子修饰酶。如聚乙二醇、右旋糖酐、肝素等多糖以及白蛋白、多聚氨基酸等，可通过共价键连结于酶表面，形成一个覆盖层，这种可溶性的固定化酶有很多有用的新性质。可溶性小分子修饰酶。由于修饰“关键功能基团”也会达到稳定化，会获得不同于天然蛋白质构象的更稳定构象；用非极性试剂修饰会加强蛋白质中的疏水作用，蛋白质的表面基团亲水化。 四、蛋白质工程 用基因操作技术高度专一性地改变目标蛋白质。第四节 固定化酶和固定化细胞固定化酶（immobilized enzyme）是指在一定空间范围内起催化作用,并能反复和连续使用的酶。 固定化酶的优点: 极易将酶与底物、产物分开； 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应； 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； 酶反应过程能够加以严格控制； 产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； 较游离酶更适合于多酶反应； 可以增加产物的收率，提高产物的质量； 酶的使用效率提高，成本降低。固定化酶的缺点: 固定化时，酶活力有损失； 增加了生产的成本，初始投资大； 只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物，对大分子底物不适用； 与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应； 胞内酶进行固定化时必须经过酶的分离纯化操作。固定化酶的制备原则: 必须注意维持酶的催化活性及专一性。 固定化应有利于生产自动化、连续化。 固定化酶应有最小的空间位阻。尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产物的量。 酶与载体必须有一定的结合程度。即不影响酶的原有构象,又使固定化酶能回收贮藏，利于反复使用。 固定化酶应有最大的稳定性。所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。 固定化酶成本要低。以利于工业使用。一、吸附法 物理吸附法：酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方法。 无机载体有多孔玻璃、活性炭、酸性白土、漂白土、高岭石、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、磷酸钙、金属氧化物等；有机载体有淀粉、纤维素、胶原等；最近，大孔型合成树脂、陶瓷等载体也十分引人注目；此外还有疏水基的载体（丁基或己基-葡聚糖凝胶），以及以单宁作为配体的纤维素衍生物等载体。物理吸附法酶活力损失少，但容易脱落。 离子吸附法(ion binding)：酶通过离子键结合与具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法。用于此法的载体有阴离子交换剂如DEAE-纤维素，DEAE-葡聚糖凝胶；阳离子交换剂如CM-纤维素，Dowex-50等。二、共价结合法(covalent binding) 酶与载体以共价键结合的固定化方法，是载体结合法中报道最多的方法。归纳起来有两类，一是将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应；另一种是在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。可与载体结合的酶的功能团有氨基、羧基、巯基、羟基、咪唑基、酚基等，参与共价结合的氨基酸残基不应是酶催化活性所必需的，否则会造成固定后酶活力丧失。 所用载体分三类：天然有机载体（如纤维素、葡聚糖凝胶等）、无机物（玻璃、陶瓷等）和合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙等），其活化方法依载体性质各不相同。三、交联法(crosslinking) 用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物与微生物细胞之间交联的固定化方法。最常见的交联剂是戊二醛。交联法反应条件比较剧烈，固定化酶活回收率一般较低。四、 包埋法(entrapment)将酶或微生物包埋在高分子凝胶细微网格中的称为凝胶包埋(gel/lattic entrapment)。载体材料有海藻酸纳、角叉菜胶、明胶和卡拉胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光胶联树脂等合成凝胶或树脂。天然凝胶采用溶胶状天然高分子化合物在酶或微生物存在下凝胶化的方法。合成高分子则采用合成高分子单体或预聚物在酶或微生物存在下聚合的方法，但会引起酶的部分失活。网格型包埋法是固定化微生物中用得最多、最有效的方法。将酶或微生物包埋在高分子半透膜中的称为微囊型包埋(microentrapsulation)。微囊型固定化酶通常直径为几微米的球状体，颗粒比网格型的要小得多，适合小分子底物和产物的酶的固定化，如脲酶、过氧化氢酶等。其制造的方法有：界面沉淀法、界面聚合法、二级乳化法和液膜法等。固定化后酶活力的变化及其原因:固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小，其专一性也能发生变化。原因可能是： 酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化，甚至会影响活性中心的氨基酸残基；固定化后，酶分子空间自由度受到限制，直接影响到活性中心对底物的定位作用；内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻；包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能透过膜与酶接近。固定化对酶稳定性的影响 大多数情况下，酶固定化后稳定性有所提高：固定化酶热稳定性提高；对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高；固定化酶对pH稳定性、对蛋白酶稳定性、贮存稳定性和操作稳定性都有提高。固定化后酶稳定性提高的原因： 酶分子与载体多点连接，可防止酶分子变形； 酶活力的缓慢释放； 抑制酶的自降解。辅酶物质的固定化 举例：酪氨酸脱羧酶的固定化需要磷酸吡哆醛为辅酶。这类辅酶可以采用下面的方法：CNBr活化结合法、重氮反应等共价偶联法 ；通过磷酸吡哆醛亲和结合法。 亲和固定法的优点是它对酶蛋白的高级结构影响较小；缺点是由于在亲和结合中要用去酶的一个活性中心，酶将因此失去部分催化能力。 酶蛋白和辅酶结合弱，固定化后需要补充另外相应的辅酶物质，酶才能发挥其正常的催化功能。 为了防止辅酶物质的流失，通常的办法是先将它们结合于水溶性载体如葡聚糖等上，然后再和固定化的酶蛋白混合一并放于半透膜内。偶联酶系的固定化一些生化反应需要多种酶协同完成，固定化的偶联多酶系统是符合这种要求的高效而简便的应用形式。偶联的多酶系统可以通过多种方式进行固定化：用胶或微囊进行混合包埋；以共价偶联方式共固定于同一载体上或分别固定于不同颗粒或膜结构上。固定化细胞优越性： 1)无需进行酶的分离、纯化，减少酶活力的损失，降低成本； 2）可以进行多酶反应，且不需添加辅助因子； 3）保持酶的原始状态，酶的稳定性更高，对污染的抵抗力更强； 4）细胞生长停滞时间短，细胞多，反应快。固定化细胞的缺点： 1) 菌体自溶，影响产物纯度； 2）细胞内蛋白酶对目的酶的分解； 3）胞内多酶的存在会形成副产物； 4）载体、细胞膜、细胞壁会造成底物渗透与扩散障碍。 固定化细胞物理吸附法 主要利用细胞与载体之间的静电引力和专一的亲和作用，使细胞规定在不同的载体（如硅藻土、陶瓷、玻璃和塑料）上。如酵母细胞带负电荷，在固定化时可用带正电荷的载体使其固定化。包埋法 将细胞包埋在多孔在体内而制成固定化细胞的方法。这是固定细胞最常用的方法。包埋法分为凝胶包埋法和半透膜包埋法等。常用的包埋材料为聚丙烯酰胺、琼脂、明胶、海藻酸钙和角叉（菜）胶等，其中聚丙烯酰胺应用最多最早。直接固定化法不用载体，借助物理或化学方法将细胞直接固定的方法。这种固定化既可发生在细胞结构上，也可通过细胞聚集来完成。对于微生物，可以借助加热、冰冻或-射线等物理手段进行固定化，也可应用柠檬酸、各种絮凝剂、交联剂和变性剂等处理达到固定化。固定化酶在食品工业中的应用：固定化酶在淀粉和糖工业中的应用u 固定化葡萄糖异构酶生产高果糖浆u 固定化蔗糖酶有蔗糖生产转化糖u 固定化-半乳糖苷酶水解棉子糖固定化酶在乳制品中的应用u 固定化-半乳糖苷酶（乳糖酶）水解乳糖u 固定化过氧化氢酶用于牛乳的灭菌固定化酶在饮料和果汁生产中的应用u 固定化酶在啤酒生产中的应用u 固定化酶在果汁生产中的应用u 在速溶茶生产中的应用固定化酶在油脂改性中的应用u 固定化1, 3-特异性脂肪酶催化酯交换，将棕榈油改性为代可可脂。固定化酶在食品添加剂和调味剂中的应用u 固定化富马酸酶生产L-苹果酸等酸味剂。u 固定化酶生产L-谷氨酸、赖氨酸等。u 固定化酶生产阿斯巴甜等甜味剂。u 固定化酶直接作为食品的防腐剂使用。固定化酶在食品分析与检测中的应用u 葡萄糖酶传感器： 葡萄糖氧化酶+氧电极u 脲酶电极法测定食品赖氨酸的含量u 固定化蔗糖转化酶,葡萄糖变旋酶及葡萄糖氧化酶的复合酶膜组成的过氧化氢双电极系统,可同时测定样品中蔗糖和葡萄糖的含量u 在酿酒过程中,将乙醇酶和葡萄糖氧化酶固定成酶膜,与电极连接,制成的生物传感器可监控葡萄糖和乙醇的浓度;u 利用嘌呤氧化酶电极,检测酶催化反应中过氧化氢的产生量,可对鱼新鲜度进行测定;u 淀粉双酶传感器能够测定食品中淀粉的含量。第五节 酶反应器(Reactors for enzymatic catalysis)什么是酶反应器？用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。酶反应器是用于完成酶促反应的核心装置。它为酶催化反应提供合适的场所和最佳的反应条件，以便在酶的催化下，使底物（原料）最大限度地转化成产物。它处于酶催化应过程的中心地位，是连接原料和产物的桥梁。酶反应器类型(1) 批量式酶反应器又称为间歇式反应器（Batch Stirred Tank Reactor ，BSTR）、间歇式搅拌罐、搅拌式反应罐。其特点是：底物与酶一次性投入反应器内，产物一次性取出；反应完成之后，固定化酶（细胞）用过滤法或超滤法回收，再转入下一批反应。 优点是：装置较简单，造价较低，传质阻力很小，反应能很迅速达到稳态。缺点是：操作麻烦，固定化酶经反复回收使用时，易失去活性，故在工业生产中，间歇式酶反应器很少用于固定化酶，但常用于游离酶。(2) 连续式酶反应器又称为连续搅拌釜式反应器（Continuous Stirred Tank Reactor, CSTR）、连续式搅拌罐。向反应器投入固定化酶和底物溶液，不断搅拌，反应达到平衡之后，再以恒定的流速连续流入底物溶液，同时，以相同流速输出反应液（含产物）。优点是：在理想状况下，混合良好，各部分组成相同，并与输出成分一致。缺点是：搅拌浆剪切力大，易打碎磨损固定化酶颗粒(3) 填充床反应器填充床反应器（Packed Bed Reactor, PBR）,又称固定床反应器。将固定化酶填充于反应器内，制成稳定的柱床，然后，通入底物溶液，在一定的反应条件下实现酶催化反应，以一定的流速，收集输出的转化液（含产物）。优点是：高效率、易操作、结构简单等，因而，PBR是目前工业生产及研究中应用最为普遍的反应器。它适用于各种形状的固定化酶和不含固体颗粒、黏度不大的底物溶液，以及有产物抑制的转化反应。缺点是：传质系数和传热系数相对较低。当底物溶液含固体颗粒或黏度很大时，不宜采用PBR。(4) 流化床反应器流化床反应器（Fluidized Bed Reactor, FBR）。特点是：底物溶液以足够大的流速，从反应器底部向上通过固定化酶柱床时，便能使固定化酶颗粒始终处于流化状态。其流动方式使反应液的混合程度介于CSTR的全混型和PBR的平推流型之间。FBR可用于处理黏度较大和含有固体颗粒的底物溶度，同时，亦可用于需要供气体或排放气体的酶反应（即固、液、气三相反应）。但因FBR混合均匀，故不适用于有产物抑制的酶反应。(5) 连续搅拌桶-超滤反应器(CSTR/UF)CSTR/UF结构是CSTR与UF超滤装置联用的酶膜反应器。在CSTR的出口处设置一个超滤装置，通过超滤装置，酶可以循环使用。其结构如下图所示。该超滤装置的半透膜只允许小分子产物通过，不允许大分子酶和底物通过。 该反应器适用于颗粒较细的固定化酶、游离酶和细胞以及小分子产物与大分子底物。(6) 循环反应器(Recycle Reactor, RCR)循环反应器是将部分流出物与加料流混合，然后再将其送入反应器。循环反应器可分为：外循环反应器和内循环反应器。(7) 膜反应器膜反应器（membrane reactor, MR）是将酶催化反应与半透膜的分离作用组合在一起而成的反应器。可以用于游离酶的催化反应，也可以用于固定化酶的催化反应。用于固定化酶催化反应的膜反应器是将酶固定在具有一定孔径的多孔薄膜中，而制成的一种生物反应器。膜反应器可以制成平板型、螺旋型、管型、中空纤维型、转盘型等多种形状。常用的是中空纤维反应器。第五章 酶修饰与模拟第一节、酶的修饰什么是酶分子修饰？通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。酶分子修饰的方法：(1) 酶的金属离子置换修饰把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复