叶绿体色素的提取分离和理化性质实验报告.docx

生物学导论实验报告 叶绿体色素的提取分离和理化性质 一、 提取与分离1、 实验目的学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法。2、 实验原理提取：叶绿体色素为有机酯类化合物，根据相似相容原理，常用有机溶剂提取。如酒精、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等。分离：薄层层析法是将吸附剂均匀的涂抹在玻璃板上形成一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待测分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂作流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂中。流动相通过毛细管作用由下而上逐渐浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品中各组成分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、脱吸附、再吸附的过程。由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附能力强的物质相对移动慢一些，儿媳妇能力弱的物质相对移动快一些，从而使各组分有不同移动速度而彼此分开。3、 实验材料与试剂（1）新鲜的菠菜叶；（2）体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末、展开剂（3）钵体、漏斗、三角瓶、剪刀、点样本、毛细管、层析缸、硅胶预制板、滤纸。4、 实验步骤（1） 色素提取液的制备取叶45片新鲜叶片，洗净，擦干叶表面，去中脉剪碎，放入钵体中。加入少量碳酸钙，加23ml体积分数为95%的乙醇，研磨至糊状，再加入10ml乙醇，上清液过滤，残渣再用10ml乙醇冲洗过滤。（2） 叶绿体色素的分离取硅胶预制板一个，用点样毛细管取上述提取液，平行于硅胶板的短边，距下边缘1cm处用毛细管划线，风干，重复操作34次；在干燥的层析缸中加入适量展开剂，高度0.5cm，将硅胶预制板带有色素一端放入，使其下端浸入展开剂中；当色素较好分离，展开剂前沿接近硅胶预制板的上端边缘时，取出，画线。Rf=斑点中心到原点距离/溶剂前沿到原点距离5、 实验结果与分析从上至下为胡萝卜素（橙色）：Rf=6.95/7.35=0.946 叶绿素a（蓝绿色）：Rf=5.35/7.35=0.728 叶绿素b（黄绿色）：Rf=4.95/7.35=0.673 叶黄素（黄色）：Rf=4.10/7.350.558可知，胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b、叶黄素极性依次增大，与硅胶吸附能力依次增强。同时可见其他色素带。表明叶绿体中色素不限于以上4种。二、 理化性质1、 实验目的验证叶绿素的理化性质。2、 实验原理叶绿素是一种有叶绿酸与甲醇形成的复合酯，故可发生皂化反应。叶绿素化学性质不稳定，见光分解。叶绿素中的Mg可以被H+取代而形成褐色的去镁叶绿素，去镁叶绿素遇铜则变成铜带叶绿色。3、 实验材料与试剂（1） 新鲜菠菜叶片，叶绿素提取液；（2） 刻度试管，小试管，试管架，水浴锅，10ml移液管；（3） 95%乙醇，苯，醋酸铜粉末，5%稀盐酸，醋酸醋酸铜溶液，氢氧化钠甲醇溶液。4、 实验步骤（1） 光对叶绿素的破坏取两支小试管，各加入2.5ml叶绿体色素提取液，一支放在阳光下，另一支用锡纸包好，40分钟后观察；取实验一中薄层层析分离成的硅胶色谱板一个，按长度方向将一半用锡纸包好，放在阳光直射下半小时，观察。（2） 皂化作用取一支10ml刻度试管加入3ml叶绿体色素提取液，加入1ml氢氧化钾甲醇溶液，充分摇匀；加入3ml苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1ml蒸馏水，轻轻摇匀，静置。（3） H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用取两支试管，分别加入5,ml叶绿素提取液，第二支中加入盐酸，待溶液变褐色后，加入少量醋酸铜粉末，60C水浴加热。取两片新鲜叶子，放入试管中，加入醋酸醋酸铜溶液，90C水浴。（4） 荧光现象取一只小试管加入5ml叶绿素提取液，在直射光和反射光照射下观察。5、 实验结果与分析（1）光对叶绿素的破换图中两只试管，左边为对照组，右边为实验组，在阳光照射下40分钟。可以看出，右侧试管中提取液颜色较浅，是由于色素见光分解特别叶绿素受光影响更大。右侧色素颜色稍浅。这个实验并不成功，主要原因是天气，阴天阳光照射不够强。 (2)皂化作用分层现象明显，上层黄色，下层绿色，第三层为乳白色。苯层中溶有叶黄素、胡萝卜素，乙醇层中为皂化的叶绿素，下层为实验操作失误造成的乳化现象。（3）H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用 左图：左侧为对照组，右侧为褐色，是因为生成了去镁叶绿素。右图：左侧为对照组，右侧绿色加深，是由于变成铜代叶绿素，但由于醋酸铜量过多，有沉淀。 叶片几分钟后变黄，是因为生成了去镁叶绿素，最终变成深绿色，是由于变成铜代叶绿素。 左图为反射光，呈红色，右图为直射光，成绿色。 其主要原理是由于叶绿素有两个不同的吸收峰。叶绿素吸收光的能力极强，如果把叶绿素的丙酮提取液放在光源与分光镜之间，可以看到光谱中有些波长的光被吸收了。因此，在光谱上就出现了黑线或暗带，这种光谱叫吸收光谱。叶绿素吸收光谱的最强区域有两个：一个是在波长为640nm660nm的