Western Blot检测 SOP(待改).doc

WB检测标准流程Western Blot检测 SOP1 目的 为了使生产活动正常进行，特制定本规程。2 范围 适用于Western Blot检测工作人员的生产活动。3 责任 生产部门组织制定和实施，行政部负责监督。4 程序 4.1 WB检测原理蛋白质印迹(Western blot)，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。WB采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 4.3 细胞和组织裂解液制备标准流程 4.3.1 贴壁细胞: 去除培养基，用冰冷的的PBS洗三次， 6孔板加50-100ul EBC裂解液，直径10cm平皿或25cm2(T25)培养瓶加200-400ul裂解液，一般加200ul合适，用细胞刮使裂解液与细胞充分接触（通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会裂解），再将刮下的裂解液收集于离心管中。4.3.2 悬浮细胞:离心收集细胞，用冰冷的PBS洗三次，每次5ml左右，用手指轻弹收集细胞管管壁，使细胞均匀散开，1000-2000rpm离心根据细胞压积每100ul加1ml裂解液，再用手轻弹细胞管管壁，使裂解液与细胞充分接触，以便于充分裂解细胞。4.3.3 组织：分析天平准确称取组织，将组织用PBS清洗干净，按照1g组织加10ml裂解液（Tissue lysis buffer）的比例加入适量裂解液并将组织剪碎，转移到玻璃匀浆器中，研磨1020min，直到将组织充分磨碎，将研磨液转移到离心管中。4.3.4 将收集出来的裂解液于冰浴(冰盒)中置摇床上孵育2小时，待细胞充分裂解后，13000rpm离心15min，小心取上清（避免残渣和脂肪），重复一次（除尽残渣，残渣内含大量DNA,RNA）加入6x loading buffer（上样缓冲液），煮沸(5-10min)，分装，于-80冰箱长期贮存。（一般可贮存1-2年）4.3.5 蛋白定量与质控，采用酶标仪定量，然后蛋白电泳考马斯亮蓝染色观察条带是否清晰，有拖带或条带不完整的应丢弃。根据电泳也可目测蛋白浓度。4.4 WB检测标准流程4.4.1 制备SDS-PAGE胶视蛋白分子大小来选择不同的胶浓度，通常为6%-12% （分子量5-20KDa用双层Tricine-SDS-PAGE小于5KDa用三层Tricine-SDS-PAGE配方见下表）；分子量15-30KDa，15% SDS-PAGE；分子量30-90KDa ，12% SDS-PAGE；分子量60-120KDa ，10% SDS-PAGE；分子量90-120KDa，8% SDS-PAGE；分子量大于120KDa，6% SDS-PAGE）比例配制分离胶，加入异丙醇封闭，静置10-20min（视温度而定，一般手指轻压短玻板，液面肉眼不见上升即聚合。室温 15min已聚合，37 30KDa ，24V 18min 大分子根据凝胶浓度适当延长时间)4.4.4 染色步骤（可选）4.4.4.1 洗膜3次，每次5min，轻摇4.4.4.2 放入氨基黑染液中染色30sec，轻摇4.4.4.3 在脱色缓冲液中脱色，换液几次，轻摇，直到蛋白条带清晰而背景变白。4.4.4.4 如果马上使用膜，保持膜的湿润。也可干燥后常温下放置一年。干燥的膜使用前浸泡甲醇。4.4.4.5 封闭用PBST配制5%的脱脂奶粉（封闭液），每张膜加50ml左右封闭液，根据时间安排选择放入电热恒温箱么37摇动封闭1-2h，或4过夜。一抗孵育用抗体稀释液（5% 脱脂奶粉的PBST溶液）稀释抗体至合适的倍数（细胞上清不稀释，小鼠血清1：500、腹水1：1000、纯化后腹水1：2000不等）；对于细胞上清1:1稀释。将膜封至杂交袋中，加入稀释后的抗体，根据时间安排37 1-2h或4温孵育过夜。二抗孵育一抗孵育后将膜取出，PBST洗涤3次，每次5min左右。用抗体稀释液（3%脱脂奶粉或的PBST溶液）稀释二抗（羊抗鼠、羊抗兔）至合适倍数（视购买二抗效价而定，现在使用的稀释度为3万倍稀释）。将膜封至杂交带中，加入稀释后的抗体，室温摇动孵育40min-2h左右。4.4.5 X-光片显影曝光将二抗孵育后的膜取出，洗涤3-5次，每次5min左右。将显色A、B液按1：1放入EP管中，充分混匀，使之恢复至室温；在膜上充分混匀AB混合液（一般每张膜400ulAB液），平铺在玻璃纸上， X-光片压入曝光暗盒，曝光几秒至几小时不等，视与AB液混合后的膜发出的荧光亮度而定（根据曝光经验而定，肉眼可见荧光压片5-15s肉眼不可见，曝光1分钟左右，若洗片后无条带或条带较淡适当延长时间）。用显影液浸泡10-20秒，清水冲洗，定影液冲洗10-20秒，再清水冲洗洗净晾干。4.5 工作难点和注意事项4.5.1 SDS-PAGE凝胶制备4.5.1.1 玻璃板检漏 4.5.1.2 按配方准确配液 4.5.1.3 灌胶过程避免产生气泡 4.5.1.4 压胶液充分吸净，插梳子过程避免产生气泡4.5.2 电泳4.5.2.1 电泳槽安装过程避免漏液 4.5.2.2 点样过程勿串孔，点不同样品时注意换枪头。 4.5.2.3 电泳时正负极安装正确（红正黑负或白正黑负） 4.5.2.4 电泳之前查清楚目的蛋白大小，以确定所用凝胶浓度、电源电压、时间等实验条件（一般情况下，蛋白分子量越大，电泳时间越长，转膜时间越长）。电泳过程若有漏液注意及时补满 4.5.3 转膜4.5.3.1 PVDF膜用前用甲醇浸泡5分钟，再用转膜缓冲液浸泡5分钟 4.5.3.2 所用的滤纸，纤维垫等用缓冲液浸泡透 4.5.3.3 从正极到负极按垫子-滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸-垫子的顺序装好。注意检查正负极。每层之间用玻棒将其中的气泡全部赶出4.5.3.4 卡子夹好后不要错位，避免PVDF膜-凝胶错位4.5.3.5 开始转移时检查电源正负极。 4.5.3.6 转膜过程冰浴 4.5.3.7 PVDF膜全程都应在液体中,避免膜干燥。对膜的各种操作都要带手套、尽量轻柔，不能有任何刮痕。 4.5.4 一抗孵育用塑料杂交袋封闭一抗时，避免袋中有大量气泡，以免一抗孵育不均匀。4.5.5 二抗孵育4.5.5.1 注意二抗种属需根据一抗确定4.5.5.2 用塑料杂交袋封闭二抗时，避免袋中有大量气泡，以免二抗孵育不均匀。 4.5.5.3 二抗稀释倍数可根据所选用的不同公司二抗效价调节。 4.5.6 显色曝光4.5.6.1 在用化学发光底物显色前需将膜上洗涤液吸干 4.5.6.2 尽量避光，以免荧光快速猝灭 4.5.6.3 曝光过程完全避光，曝光时间由发光强度而定，从3秒到几个小时不定。4.5.7 裂解液制备4.5.7.1 裂解液制备注意全程必须在冰上进行 4.5.7.2 细胞或者组织使用前必须先用PBS洗干净，比保证将血清等洗净，尽量避免引入杂蛋白4.5.7.3 洗涤完成后尽可能的吸干残留的PBS 4.5.7.4 保证裂解充分4.5.7.5 离心后取上清要避免取到碎片沉淀和漂浮的脂类 4.5.7.6 制备好的裂解液按200ul每管分装，使用时避免反复冻融。4.6 WB相关溶液配制4.6.1 30%聚丙烯酰胺丙烯酰胺29g，N,N-二甲基甲叉双丙烯酰胺1g，用去离子水定容至100ml，pH值不超过7.0，过滤除菌，4棕色玻璃瓶贮存。有神经毒，配置时需戴口罩，手套。4.6.2 1.5mol/L, pH 8.8 Tris-HCl贮存液在80ml去离子水中溶解18.17gTris碱，加入浓HCl调节pH值至8.8，加去离子水定容至100ml，分装后高压灭菌。4.6.3 1.0mol/L, pH 6.8 Tris-HCl贮存液在80ml去离子水中溶解12.11gTris碱，加入浓HCl调节pH值至6.8，加去离子水定容至100ml，分装后高压灭菌。4.6.4 5 x Tris-甘氨酸缓冲液在900ml去离子水中溶解15.1gTris碱和72g甘氨酸，然后加入50ml 10%电泳级SDS溶液，加去离子水定容至1L。4.6.5 10%SDS溶液称取10gSDS，加90ml超纯水，68加热溶解，加微量盐酸调pH至中性，定容至100ml。注意佩戴口罩，致肺癌性。4.6.6 10%APS溶液（过硫酸铵）称取1gAPS，将加入9ml超纯水，待溶解后定容至10ml，-20保存。4.6.7 TEMED(四甲基乙二胺)分装4保存4.6.8 转膜缓冲液10 x转膜：甘氨酸144g，Tris碱30g4.6.9 2xSDS加样缓冲液100mmol/L Tris-HCl(pH6.8)，200mmol/L DTT或-巯基乙醇(临用前加入)，4%SDS，0.02%溴酚兰，20%甘油4.6.10 5xPBST2g KCl，2g KH2PO4,80g NaCl, 28.9gNa2HPO4,去离子水配制至2L，再加入5ml Tween-20 ，快速搅拌3-4h，室温保存4.6.11 封闭液5g脱脂奶粉，100ml 1xPBST，混匀，4保存4.6.12 细胞裂解液EBC buffer：20mM Tris-HCl(pH8.0)，125mM NaCl，0.5%NP-40,20mM NaF，0.2mM Na3VO4，2mM EDTA，高压灭菌，4保存。临用前加入DTT(1:1000),PMSF(1:200),COCKTAIL(1:100),EDTA(1:500)1mM EDTA，1mM DTT,1mM PMSF4.6.13 组织裂解液50mM Tris (pH7.5)，650mM NaCl， 5%Triton-X100,50mM NaF，50mM NaPi(pH7.5)，50mM NaPPi(pH7.5)。临用前加入DTT(1:1000), PMSF(1:200), COCKTAIL(1:100),EDTA(1:500)1mM EDTA，1mM DTT,1mM PMSF4.6.14 SDS-PAGE电泳缓冲液阴(负)极缓冲液： PH8.25 Tris： （0.5M）Tricine： （0.