细胞融合的方法、过程和影响因素.ppt

第四章 1 细胞融合CellFusion 细胞融合概念 融合方法 融合过程 融合的影响因素 细胞融合 细胞融合 cellfusion 又称somatichybridizationorcellhybridization 指在自然条件下或人工方法使两个或两个以上的细胞通过无性方式融合形成一个杂合细胞的过程 它能重新组合两个亲本细胞的优良遗传信息 是研究细胞间遗传信息传递 基因在染色体定位 改良动物遗传特性及创造新的符合人类需要的新的细胞系极为有效的手段 自发融合 受精过程 成肌细胞融合 巨噬细胞融合 体外培养系统中的细胞融合诱发融合 一 细胞融合的概念 1962年Okata发现仙台病毒可诱发艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞体 开创动物细胞融合的暂新领域 SingerandNicolson sModelofmembranestructure Thefluid mosaicmodelisthe centraldogma ofmembranebiology Thecorelipidbilayerexistsinafluidstate capableofdynamicmovement Membraneproteinsformamosaicofparticlespenetratingthelipidtovaryingdegrees TheFluidMosaicModel proposedin1972bySingerandNicolson hadtwokeyfeatures bothimpliedinitsname Thechemicalcompositionofmembranes A MembraneLipids TheFluidPartoftheModel Phospholipids Phosphoglyceride磷酸甘油酯andsphingolipidsGlycolipidsSterols isonlyfoundinanimals Membranelipidsareamphipathic Therearethreemajorclassesoflipids AnOverviewofmembranefunctions 1 Definetheboundariesofthecellanditsorganelles 2 Serveaslociforspecificfunctions 3 provideforandregulatetransportprocesses 4 containthereceptorsneededtodetectexternalsignals 5 providemechanismsforcell to cellcontact communicationandadhesion 细胞融合机理细胞融合的关键 脂双层的接触靠近 细胞桥形成 胞质渗透 细胞核融合 胆固醇 磷脂 糖脂 寡糖 疏水a螺旋 鳌合蛋白 极性孔 蛋白分子 Hydrophobic疏水的Hydrophilic亲水的 二 诱发细胞融合的方法 病毒 化学 PEG 电融合 1 病毒促进细胞融合 病毒类融合剂是研究的最早的促融剂 一些致癌 致病病毒如疱疹病毒 天花病毒 副流感型病毒 副黏液病毒等 都能诱导细胞融合 但由于毒性大 应用上收到很大限制 仙台病毒 HVJ 是一类被膜病毒 诱导细胞融合的不是仙台病毒内部的RNA 而是它的外膜 这一现象对你有何启示 HVJ促融机制 当病毒位于两个细胞间时 病毒表面spike上神经氨酸酶降解细胞膜上的糖蛋白 使细胞膜局部聚集在病毒周围 在高pH和Ca2 条件下局部细胞膜发生融合 2 化学融合剂促进细胞融合1975年Kao和Chayluk报道PEG polyethyleneglycol PEG 可促进细胞融合 Pontecorvo报道PEG促融效率高于仙台病毒100 300倍 PEG是一种多聚化合物 商品名卡波蜡Carbowax 分子量200 20000 靠醚键的联结使其分子末端带弱负电荷 目前已衍生达50多种 聚乙二醇 PEG 介导的细胞融合 原理 PEG带有大量的负电荷 和细胞膜表面的负电荷在Ca2 的连接下 形成静电键 促使异源的细胞膜间的粘着和结合 在高pH 高Ca2 溶液的作用下 将Ca2 和与质膜结合的PEG分子洗脱 导致电荷平衡失调并重新分配 使两种细胞膜上的正负电荷连接起来 进而形成具有共同质膜的融合体 注意事项 1PEG融合的关键是作用时间2PEG规格和纯度与融合效率有关3融合与细胞密度有关4融合液中加入少量CaCl2 即维持一定电导率 对细胞也有保护作用 3 电融合技术 Electroporation 3 注意事项 1 对介质要求高 一般用高纯度的蒸馏水并选用适当的非电介质溶液 如甘露醇等配制等渗性介质 2 注意控制高频交流电压和直流脉冲电压的强度和时间 以防止细胞连接成串或发生可逆性降解 融合参数 主要包括交流电压 交变电场的振幅频率 交变电场的处理时间 直流高频电压 脉冲宽度 脉冲次数等 优点 融合率高 达70 80 甚至100 融合率 融合组多核细胞的核数 对照组多核细胞的核数 对照组的全部细胞数 100 可在显微镜下定向诱导细胞融合可直接挑选杂种细胞 原理 两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞 筛选的目的是获得优良的杂种细胞 1 亲本2 同核体homokaryon 同源细胞融合体 它们的基因型和表现型完全一样 3 异核体heterokaryon 异源细胞的融合体 它们含有双亲细胞核和细胞质物质 4 多核体 含有双亲不同比例核物质的融合体5 异胞质体 具有不同胞质来源的杂合细胞 6 核质体 有细胞核而带有少量细胞质的亚原生质体 第二节融合细胞的筛选 动物细胞融合的筛选方式 1 利用抗药性筛选系统 利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞 亲本A 对氨苄青霉素敏感 对卡那霉素不敏感亲本B 对卡那霉素敏感 对氨苄青霉素不敏感杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长 2 营养互补筛选系统 细胞在缺乏一种或几种营养成分时 不能生长繁殖 即营养缺陷型细胞 利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞 亲本A 色氨酸缺陷型亲本B 苏氨酸缺陷型杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养 而亲本细胞均会死亡 3 温度敏感突变型杂种细胞的筛选 一般的培养细胞能在37度范围内生长 但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长 由此筛选杂种细胞 亲本一 具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长 亲本二 高温敏感突变型 但不能抗卡那霉素 杂种细胞能在高温和含卡那霉素的培养基上生长 4具有所需性状杂种细胞的筛选 HAT选择系统 基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选 HAT是含一定浓度次黄嘌呤 Hypoxanthine H 氨基喋呤 Aminopterin A 及胸腺嘧啶核苷 Thymidine T 的一种选择性培养基 其中三种成分与细胞DNA合成有关 DNA合成途径有两种 需两种酶 胸腺嘧啶核苷激酶TK酶 催化胸腺嘧啶核苷产生脱氧胸苷酸 次黄嘌呤磷酸核苷转移酶HGPRT酶 催化次黄嘌呤产生肌苷 主要途径由氨基酸和其他小分子化合物合成核苷酸 进而合成DNA 叶酸是必不可少的媒介 参与嘌呤和嘧啶甲基合成 氨基蝶呤抑制FH2活性 阻断FH2到FH4合成 杂交瘤技术中 常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷 HPRT 骨髓瘤细胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型 TK 骨髓瘤细胞为亲本之一 HPRT 细胞的嘌呤只能由全合成途径产生 TK 细胞的嘧啶只能由全合成途径合成 含氨基喋呤A培养基抑制了细胞内嘌呤和嘧啶的全合成途径 基于HAT培养基的筛选系统 H Hypoxanthine次黄嘌呤 应急途径中所提供之外源核苷酸前体A Aminopterin 氨基喋呤 阻断核苷酸的从头合成T Thymidine 胸腺嘧啶 应急途径中所提供之外源核苷酸前体 HGPRT酶缺陷型细胞株 长期培养系 不能在HAT培养液中生长 正常细胞 体外生存能力有限 最终也将死亡 融合细胞 最后 只有融合细胞在HAT培养液中存活 第三节融合细胞克隆化 利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特异抗体的细胞系 在培养过程中 一般要加能释放某些生长因子促进杂交瘤生长的饲养细胞 如小鼠的腹腔巨噬细胞 脾细胞或胸腺细胞等 方法有有限稀释法 软琼脂培养法 显微操作法 应用荧光激活分选仪等 通过适当的稀释达到分离单个细胞进行培养的目的1 取出阳性孔内的细胞进行计数2 用培液将其稀释到例如每毫升内10个细胞 3 如果在96孔板内每孔加0 1ml 每孔内将为一个细胞4 加入一定数量的饲养细胞 经过8 12天后 可观察到有集落生长的孔 5 根据检测的阳性结果再次进行克隆化 有限稀释法 在加入饲养细胞的无菌平皿内铺上一层0 5 的琼脂 待凝固后再铺上一层混有杂交瘤细胞的0 25 的软琼脂 待细胞长成集落后 用毛细管吸出移种于含饲养细胞的96孔板内 软琼脂培养法 第四节杂种细胞在细胞生物学研究中的应用 1 基因定位不同种属的细胞融合时 常会出现一个亲本细胞的染色体被优先排除 而另一个亲本的染色体被选择性留下 即染色体分离的现象 由此 可根据表型和与表型特征相对应的基因在特定染色体上 例如 HGPRT 人细胞与TK 的小鼠细胞融合后 可用HAT培养基分离得到一种仅含一条人E组染色体的杂种细胞 具有TK活性 由此得到人的TK基因是在E组染色体上的 2 体细胞杂种的致瘤性分析通过正常二倍体细胞和致瘤性或病毒转化细胞的融合来进行致瘤性的遗传分析 3 遗传缺陷的基因互补基于杂种细胞的基因互补作用 可分为基因间和基因内的互补作用 即杂种细胞可以具有两种亲本