日本血吸虫真核翻译起始因子5基因的cDNA克隆和免疫保护.pdf

动物学研究2 0 0 5 Oc t 2 6 5 5 1 3 5 1 7 Zo ol og i c a l Re s e ar c h C N 5 3 1 0 4 0 Q I S S N 0 2 5 4 5 8 5 3 Cl o n i n g a n d Fun c t i o n a l An a l y s i s o f t h e Ful l Le n g t h c DNA S e q u e n c e o f Eu k a r y o t i c Tr a n s l a t i o n I n i t i a t i o n F a c t o r 5 i n S c h i s t o s o ma j a p o n i c u m CHE NG Gu o f e n g L I N J i a o l i a o SUN J u n L I Ha o Z HU Ch u a n g a n g Z HOU Yu a n c o n g C AI Y o u mi n f 1 S h a n g h a i I n s t i t u t e o fA n i m a l P a r a s i t o l o g y C h i n e s e A c a d e m y ofA g r i c u l t u r al S c ie n c e s K e L a b o r a to r y ofA n i m a l P a r a s i t o l o g y Mi n i s t r o fA g r ic u lt u r e of C h i n a S h a n g h a i 2 0 0 2 3 2 C h i na 2 I nst i t u t e ofB i o c h e m i s t r y a n d C e l l B io l o g y S h a ngh a i I nst it u t e s f o r B i o l o g i c a l Scie n c e s th e C h i n e s e A c a d e m y ofScie n c e s S h a n g h a i 2 0 0 0 3 1 C h i n aJ Ab s t r a c t T h e e x p r e s s e d s e q u e n c e t a g o f e u k a r y o t i c t r a n s l a t i o n i n i t i a t i o n f a c t o r 5 e 5 f r o m t h e S c h i s t o s o m a j a p o n i c u m a d u l t wo r n l c DNA l i b r a r y t hrou g h s u bt r a c t i v e h y brid i z a t i o n b e t we en ma l e a n d f e male wo r n l s wa s a naly z e d b y t h e bioi n f o r ma t i c s me t ho d Th e o v e r l a p pi n g s e q u e nc e s we r e a s s e mbl e d i nt o o n e t h a t i n c l ud e s t h e c omp l e t e o p e n r e a d i n g f r a me G e n B a n k a c c e s s i o n n u mb e r A Y 6 8 6 5 0 1 T h e f u l l l e n g t h c D N A o f 5 W as c l o n ed i n t o a p E T 一 2 8 e I l v e c t o r w h i c h g e n e r a t e d a p rok a r y o t i c e x p r e s s i o n p l asmi d a n d a f u s i o n p rot e i n o f l 8 k Da Was i n d u c ed i n E s c h e r i c h i a c o l i Th e r e c o mb i n a n t e x p r e s s i o n o f e F 5 p rot e i n o f S c h i s t o s o m a j w o m W as p u ri fi e d T h e i mm u n o p r o t e e t io n t e s t aga i n s t s c h i s t o s o m i a s i s d e mo n s t r a t e d t ha t t h e r e c o mbi n a n t p r o t e i n wor k e d t o a c er t a i n e x t en t e s p e c i all y i n t h e t l u e t i o n o f e g g s i n t h e l i v e r o f t he h o s t Ke y w o r d s S c h is t o s o m a j a p o n i c u m e l F 5 E x p res s i o n V a c c i n e 日本血 吸虫真核翻译起始 因子 5基 因的 c D N A克隆 和免疫保 护功能分析 程 国锋 林 矫矫 孙 军 李 浩 朱传 刚 周元聪 蔡幼 民 1 中国农业科学院 上海家畜寄生虫病研究所 农业部动物寄生虫学重点实验室 上海2 0 0 2 3 2 2 中国科学院上海生命科学研究院 上海生化细胞所 上海2 0 0 0 3 1 摘要 利用抑制削减杂交法筛选 日本血吸虫雌雄虫差异 基因 从中获得 真核翻译起 始因子 5基因 e l F 5 的 表达序列标 对该序列进行生物信息学分析 对其 5 端进行电子延伸 获得含完整开放阅读框的 c D N A序列 A Y 6 8 6 5 0 1 将其亚克隆到表达载体 p E T 一 2 8 e 进 行重组 表达 免疫保护效果实验表 明 重组表 达蛋 白具有 显著 抑制血吸虫卵在寄主肝脏中的沉积效果 关键词 日本血 吸虫 真核翻译起始 因子 5 e l F 5 表达 疫 苗 中图分类号 Q 9 5 9 1 5 5 Q 7 8 5 R 9 7 9 9 文献标 识码 A 文章编号 0 2 5 4 5 8 5 3 2 0 0 5 0 5 0 5 1 3 0 5 S c h i s t o s o mi a s i s c a u s e d b y S c h i s t o s o m a j a p o n i c u m i s a m a j o r p u b l i c h e a l t h p r o b l e m i n C h i n a a n d S o u t h e a s t A s i a C h e n e t a l 2 0 0 2 S c h i s t o s o m e s p o s s e s s a c o mp l e x l i f e c y c l e s i n v o l v i n g s e v e r a l d i s t i n c t de v e l o p me n t a l s t a g e s i n i n v e r t e b r a t e a n d v e rte b r a t e h o s t s At p r e s e n t t h e r e ha s o n l y b e e n l i mi t e d s u c c e s s i n e r a d i c a t i n g t h i s pa r asi t i c d i s e as e d e s pi t e i nt e n s i v e e ffe c ts i n v o l v i n g c h e mo t h e r a p y v e c t o r e l i mi n a t i o n a n d h e a l t h e Re c e i v e d d a t e 2 0 0 5一O 5 0 8 Ac c e p t e d d a t e 2 0 0 5 0 8 1 5 C o r r e s p o n d i n g a u t h 0 r 通讯作者 E ma i l c h e n g g f e n g y a h o o c o n c n T e l 8 6 2 1 5 4 0 8 2 5 0 3 F a x 8 6 2 1 5 4 0 8 I 8 l 8 收稿 日期 2 0 0 5 0 5 0 8 接受 日期 2 0 0 5 0 8 1 5 基金项 目 国家高技术研究发展项 目 8 6 3 计划 2 0 0 1 A A 2 1 5 1 5 1 上海市重大科技攻 关项 目 0 3 D Z 1 9 2 3 1 维普资讯 5 1 4 动物学研究 2 6卷 d u c a t i o n Mo r e o v e r c h e mo t h e r a p y ma i n l y u s i n g pr a z i q u a n t e l i n d u c e s d r u g r e s i s t a n e a mo n g p a r a s i t e s Ro s s e t a 1 2 0 0l 1 T h e r e f o r e d e v e l o p me n t o f a n e f f e c t i v e v a c c i ne ma y l e s s e n t h e p a t h o g e n e s i s a n d di s s e mi n a t i o n o f t h e p a r a s i t e s i n t h e v e t e r b r a t e h o s t a n d t hu s p o t e n t i a l l y c o n t r o l s c h i s t o s o mi a s i s An u n i qu e t r a i t o f s c h i s t o s o me s i s t h e i r s e x u a l l y d i mo r p h i c c h a r a c t e r P r e v i o u s s t u di e s h a v e s u g g e s t e d t h e S H C e s s f ul c o mp l e t e t i o n o f s c h i s t o s o me s d e v e l o pme n t wh i c h e l i c i t t h e p a t h o g e n e s i s a n d e p i d e mi c o f n e x t c y c l e i s d e p e n d e nt o n t h e a p p r o p r i a t e s i g n a l s b e t we e n ma l e a n d f e ma l e wo r ms B a s c h l 9 8 8 C h e n g e t a l 2 0 0 5 D e n Er a s mu s l 9 8 5 Gu p t a Ba s c h 1 9 8 7 Lo Ve 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c o mb i n a nt pr o t e i n t h a t e x pr e s s e d i n E c o l i a g a i n s t s c h i s t o s o ma s i s 1 M a t e r i a l s a n d M e t ho d s 1 1 M a t e r i a l s T h e l i f e c y c l e s o f S c h i s t o s o ma j a p o n i c u m f C h i n e s e s t r a i n w e r e ma i n t a i n e d i n S h a n g h a i I n s t i t u t e o f An i ma l Pa r a s i t o l o g y b y Ne w Z e a l a n d r a b b i t s a n d On c o me l a n i 0 h a p e r i s Ad u l t s c h i s t o s o me s o b t a i n e d fro m i n f e c t e d r a b bi t s we r e i n f e c t e d wi t h l 5 0 0 c e r c a r i a e s a f t e r 42 d a y s Z e a l a n d r a b b i t s a b o u t 3 5 k g m a l e a n d B a l b c mi c e a b o u t 2 5 g ma l e we r e p u r c h a s e d fr o m S h a n g h a i Ex p e r i me n t a l An i ma l Ce nt e r Tr i z o l a n d S i l v e r Be a d DNA g e l i s o l a t i o n k i t s we r e s u p pl i e d b y S h a n g h a i S a n g o n Bi o l o g i c a l En g i n e e rin g T e c h n o l o gy S e r v i c e C o 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c u t a n e o u s l y i n j e c t e d w i t h 5 0 g f u s i o n p r o t e i n e mu l s i fi e d i n t h e s a me v o l u me o f F r e u n d s C o mp l e t e Ad j u v a n t F C A w h i l e c o n t r o l g r o u p s w i t h P B S i n t h e s a l n e v o 1 u me o f F C A a n d c h a l l e n g e d wi t h 4 0 1 c e r c a r i a e s o f S c h i s t o s o ma j a p o n i c u m a f t e r t w o w e e k s i n t h e t h i r d v a c c i n a t i o n t h e n s a c rific e d t o p e r f u s e t h e wo r n i s aft e r 4 2 d a y s Th e i mmu n o p r o t e c t i o n wa s a s s e s s e d b y t h e r e d u c t i o n p e r c e n t a g e o f wo r n i s a n d e g g s i n t h e v a c c i na t e d a n i ma l s c o mp a r e d wi t h c o n t r o l s S t a t i s t i c a l a n aly s i s e m p l o y e d a o n e wa y AN0VA 2 Re s u i t s 2 1 An a l y s i s o f S j e l F5 b y b i o i n f o r ma t i c s As s h o wn i n Fi g 1 a 1 3 2 8 b p c DNA s e q u e n c e wa s a s s e mbl e d wh i c h i n c l u d e d i n i t i a l c o d o n ATG a nd 3 p l o y A t a i l I t c o n t a i n e d a 3 7 5 b p O R F e n c o d i n g a p r o t e i n o f 1 1 9 a mi n o a c i ds wi t h t h e i n i t i a l c o d o n ATG a t p o s i t i o n 8 53 a n d s t o p c o d o n T GA a t p o s i t i o n 1 2 0 9 Th e s e qu e n c e o f t h e c DNA c a n b e o bt a i n e d f r o m Ge n B a n k G e n B a n k a c c e s s i o n n u m b e r A Y 6 8 6 5 0 1 T h e p u t a t i v e p r o t e i n o f s j dr 5 c o n t a i n s t h e W2 d o ma i n wh i c h p e r f o r ms f u n c t i o n s o f c o n s e r v e d p r o t e i n p r o t e i n i n t e r a c t i o n d o ma i n i n t r a n s l a t i o n f a c t o rs S e q u e n c e a l i g n m e n t o f e l F 5 b e t w e e n S j a p o n i c u m a n d S ma n s o n s h o we d t h e y e x hi bi t e d 6 7 i d e n t i t y a t t h e p r o t e i n l e v e l F i g 2 2 2 E x p r e s s i o n o f t h e r e c o mb i n a n t S j e W S i n E c o l i Th e c DNA f r a g me n t e n c o di n g i F5 wa s c o r r e c t l y c l o ne d i n t o t h e pE T28 c v e c t o r wh i c h was c o n firm e d wi t h b o t h d o u b l e e n z y me d i g e s t i o n an d s e qu e n c e an a l y s i s E x p res s i o n o f the f u s i o n p rot e i n r S j e i F5 i n E c o l i w as a 1 8 k D a mo l e c u l a r i n 1 0 S D S P A G E F i g 3 2 3 P u r i fi c a t i o n o f r S j e l F5 r S j e l F 5 p u r i fi e d w as s h o w e d b y S D S P A G E i n Fi g 4 2 4 I nunu no pr o t e c tio n a s s e s s m e nt Th e e x p e rime nt a l an d c o n t r o l g r o up mi c e we re s t i l l l i v i n g o n the 42 t h d a y a f t e r the c e r c a r i a es c h a l l e n g e Th e r ed uc t i o n r a t e o f wo r n i an d e g g was c o u n t e d S i g n i fic a n t e gg red u c t i o n rat e was o b s e rved i n the t es t g r o u p c o m p a r e d w i th the c o n t r o l g r o u p T a b 1 3 Di s c u s s i o n I n t h e p res e n t s t u d y t h e o f l F5 g e n e rat ed b y S S H i n t h e ma l e w o r n i l i b r a r y was c l o n ed t o o b t a i n f u l l l e n g t h c DNA s eq ue n c e s W e als o e mp l o y ed RT PCR a nd W e s t e r n b l o t t i n g t o c o nfi rm t he d i ff e ren t i all y e x p res s e d S M F 5 b e t w e e n m ale a n d f e mal e w o r n i s T h e res u l t s h o we d t h e r e i s n o s i g ni fic a n t d i ffe ren c e be t we e n male a n d f e male wo r n i s i n l Fs e x p ressi o n a t bo th t r a n s c ri p t and p rot e i n l e v e l d a t a n o t s h o w n B e c a u s e e l F5 p l a y s a n i mp o r t a nt rol e i n p rot e i n s y n the s i s we i n v e s t i g a t e d i t s e ffe c t o n p rot e c t i v e i mmu n i t y Th e r e s u l ts s h o we d t h e r e d u c t i o n r a t e s o f wo r ms a n d e g g s i n fin al h o s t we re 2 0 1 2 a n d 21 1 7 res p e c t i v e l y Mo re o v e r s i gn i fi c a n t e g g red u c t i o n rat e wa s o b s e rve d i n the t e s t g r o u p as c o mp are d wi th t h e c o n t r o l g r o up T he r e s u hs s u gg e s t e d t ha t t h e a n t i b o d i e s d i rec t e d a t t h e c l o n e d s j e l F 5 c D N A s e q u e n c e e x p res s e d ant i g e n i c e p i t o p e s t arg e t e d t h e rep r o du c t i v e o r g an o f f e ma l e wo r n i s a nd t h e n d e c rea s e d th e p r o d uc t i o n o f e g g s Ho we v e r t he d e v e l o p me n t o f wo r n i s wa s n o t s i gn i fic a n t l y s u p p r e s s e d i n t h e t e s t g r o up p o s s i b l y d u e t o the p a r a s i t i c c h a r a c t e rs o f s c h i s t o s o me s i e t h e y c a n a d j u s t t h e m s e l v e s t o s u rvi v e i n t he fi nal h o s t The a naly s i s o f s l F5 mo t i f s s h o we d h as s o me t y ros i n e k i n a s e s o m e c ase i n k i n a s e 1 I a n d s o m e p ro t e i n k i n a s e C p h o s p h o r y l a t i o n s i t e s Th e res u l t c o n fi rm e d e F5 i n c 0 n i u n c t i o n wi t h GTP i n o the r s pe c i e s a c t as a c l ass i c a l G T P a s e a c t i v a t o r p r o t e i n D as e t a1 2 0 0 1 P r e