组蛋白翻译后修饰技术研究进展_甄艳.pdf

收稿日期 2011 08 09 修回日期 2011 08 23 基金项目 国家自然基金项目 31000287 江苏省高校自然科学基础研究项目资助 10KJB220002 作者简介 甄艳 副教授 从事植物蛋白质组学研究 通讯作者 施季森 教授 研究方向为林木遗传育种 生物技术 E mail jshi njfu edu cn doi 10 3969 j issn 2095 1736 2012 02 073 组蛋白翻译后修饰技术研究进展 甄艳 施季森 南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室 南京 210037 摘要 翻译后修饰调控着真核生物大部分蛋白质的活性 这些修饰的解读对研究生物功能是必不可少的 组蛋白 翻译后修饰是蛋白质翻译后修饰中研究的较好一类小分子碱性蛋白 易被各种生物大分子修饰 尤其易发生在 N 末端的尾部 不同组合式修饰构成了 组蛋白密码 在细胞的发育 生长 分化和动态平衡中 组蛋白密码影响着 染色体的结构状态 进而调控基因的表达状态 组蛋白翻译后修饰的研究可作为一种模式来解析蛋白质复杂的修 饰状态及研究其分子功能 翻译后修饰分析技术的发展对组蛋白密码的解析是至关重要的 重点讨论组蛋白修饰 分析技术的发展和应用 关键词 组蛋白 翻译后修饰 Edman 测序 抗体 质谱 中图分类号 Q51文献标识码 A 文章编号 2095 1736 2012 02 0073 04 The advances of technological research in histone post translational modification ZHEN Yan SHI Ji sen Key Laboratory of Forest Genetics Biotechnology of the Ministry of Education Nanjing Forestry University Nanjing 210037 China Abstracts Post translational modification regulates the activity of most eukaryote proteins Deciphering of these post translational mod ifications is indispensable insight into biological function Histones with kinds of small basic proteins being subjected to various modifi cations especially at N terninal tail are the best studied proteins in post translational modification research The combination of these modifications constitutes the histone code Histone codes influence the chromatin structure modulating gene expression in develop ment growth differentiation and homeostasis of cell The investigation of modified histones can be used as a model to decipher com plex combinational modifications and to analyze their molecular functions The progress of analytical techniques however is essential to decipher the histone code In this review the application and progress of techniques applied in histone modification analysis were discussed Keywords histone post translational modification Edman sequence antibody mass spectrometry 真核生物约 146 bp 的 DNA 缠绕核心组蛋白八聚 体 各两分子的 H2A H2B H3 H4 构成了染色体的 基本单位核小体 核小体再通过 DNA 和组蛋白 H1 连 接构成染色质纤维 组蛋白不仅在染色体组装方面有 着重要的作用 而且组蛋白的翻译后修饰在调控基因 动态表达方面也有着重要的作用 组蛋白翻译后修饰 多发生在组蛋白的 N 端尾部 包括甲基化 乙酰化 磷 酸化 ADP 核糖基化 泛素化和小分子类泛素化修 饰 1 这些修饰有助于其他蛋白质与 DNA 的结合 从 而产生协同或拮抗作用来调控基因转录 例如 乙酰 化使组蛋白尾部正电荷减少 从而削弱了与带负电荷 DNA 骨架的作用 而促进染色质呈开放状态 2 甲基 37 第 29 卷第 2 期 2012 年 4 月 生 物 学 杂 志 JOURNAL OF BIOLOGY Vol 29No 2 Apr 2012 化激活或抑制基因功能主要依赖于修饰的位点 主要 与赖氨酸残基的单甲基化 双甲基化或三甲基化有 关 3 真核生物细胞组蛋白通过多样化的翻译后修饰 及这些修饰在时间和空间上的不同组合来调节基因的 功能 因此 组蛋白的翻译后修饰是一个复杂的系统 就核小体而言 其 N 端尾部易受各种修饰 如在组蛋 白 H4 的尾部可能会有三百多万种不同组合式的修 饰 为了解读组蛋白密码 有必要鉴定所有可能的组 蛋白修饰及特定修饰位点或修饰模式与特定生物功能 之间的关联 如转录 复制 染色体浓缩 基因沉默或凋 亡等 要完成这些目标需要开发一些技术来全面地鉴 定组蛋白的各种修饰并追踪组蛋白修饰的动态变化 本文综述了研究组蛋白翻译修饰的 Edman 测序技术 抗体技术及质谱技术 并着重讨论了基于质谱技术的 组蛋白修饰研究 1传统的组蛋白修饰分析技术 组蛋白翻译后修饰研究的传统方法是整合放射性 前体分子 而后将组蛋白完全水解来分析氨基酸残基 该方法所需的样品量较大 涉及到放射性试剂 而且并 不总能获得精确的修饰图谱 在早期的研究中通过该 方法鉴定了组蛋白的乙酰化 甲基化和磷酸化 4 5 Edman 测序技术是组蛋白翻译后修饰鉴定的另一个经 典方法 通过蛋白质测序方法来获得准确的序列信息 并成功地鉴定了组蛋白翻译后修饰 如通过 Edman 序 技术可以确定不同 NH2 末端乙酰化位点在高度乙酰 化状态中是随机的还是非随机的 6 该方法存在的缺 点是需要样品量大 且样品纯度要求高 样品制备繁 琐 此外 如果存在 N 末端序列封堵现象则会导致部 分序列信息丢失 因此该方法不适合分析样品量少的 细胞 也不适合在特定基因位点绘制翻译后修饰图 谱 7 2基于抗体技术的组蛋白翻译后修饰研究 继传统的组蛋白修饰分析技术之后 在20 世纪80 年代后期开发了组蛋白 H4 的乙酰化特异性抗体 利 用这种抗体和蛋白质免疫印迹杂交技术不仅识别了组 蛋白 H4 的乙酰化位点 而且还区分了不同的修饰位 点 7 并且随着荧光技术在抗体技术中的应用使得可 在第一时间定位基因组特定区域的特异组蛋白修饰的 位点 抗体技术的不断发展 已被广泛地应用到组蛋 白的其他翻译后修饰研究中 如赖氨酸和精氨酸的甲 基化或丝氨酸和苏氨酸的磷酸化等 8 染色体免疫共 沉淀技术 chromatin immunoprecipitation ChIp 是基于 体内分析发展起来的 为研究组蛋白翻译后修饰在基 因表达调控方面提供了有力的工具 ChIp 技术与 PCR 技术结合可以判断基因组中特定组蛋白出现的位 置 进而来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的 关系 该技术利用特定修饰组蛋白的抗体来进行染色 质分级 分离与特定修饰组蛋白结合的 DNA 片段 并 用 PCR 进行定量 从而了解基因组特定位置上组蛋白 修饰状态 随着该技术的不断发展 目前已可以通过 ChIP on chip 和 ChIP SAGE 技术来评估基因组水平的 组蛋白修饰 9 10 ChIP on chip 技术通过微阵列芯片 杂交技术高通量地观察组蛋白的各种修饰 进而了解 基因组 DNA 与蛋白质之间的关系 Fischer 等利用 ChIP chip 和基因表达芯片研究了 4 个组蛋白 H4ac H3ac H3K4me2 3 与基因转录的关系 结果揭示组蛋 白主要功能可能是作为特异效应分子的信号标记 11 尽管抗体技术灵敏 特异 但是基于抗体的方法需要了 解修饰的背景知识 这样才能避免交联反应和表位闭 塞 12 抗体技术往往一次检测到的组蛋白修饰的位 点很少或缺少足够多的特异抗体来识别每一种修饰 正如 Phanstiel 等所比喻的组蛋白修饰模式如同复杂的 句子 抗体只能识别一些字母或是一个单词 因此要 充分了解特定组蛋白修饰的复杂调控过程 我们还必 须考虑特定位点周围的翻译修饰状况 13 3基于质谱技术的组蛋白修饰研究 质谱是一种物理化学分析技术 可以测定气化离 子的质荷比 m z 质谱是蛋白质组学研究的核心策 略 可以无偏倚地 同时地分析蛋白质的各种修饰 也 可以进行蛋白质表达和修饰蛋白质的差异分析研究 质谱已经被成功应用到组蛋白分析研究中 且成为组 蛋白翻译修饰研究的重要工具 目前基于质谱的组蛋 白翻译后修饰的研究策略主要有三条途径 即基于 Bottom up 方法的组蛋白小肽的研究 基于 Middle down 和 Top down 方法的大肽片段 3 kDa 研究和完整蛋 白的研究 14 2 15 基于 Bottom up 方法的组蛋白修饰 分析是将分离后的单一组分的组蛋白酶解成肽片段 后 质谱分析获得肽指纹图谱或是利用液相色谱结合 串联质谱通过诱导碰撞解离 collisionally induced dis sociation CID CID 离子断裂通常发生在最弱的键上 主要形成 y 型和 b 型离子 分析部分肽序列来进行组 蛋白修饰的研究 但值得注意的是 组蛋白 尤其是核 心组蛋白富含赖氨酸残基 而胰蛋白酶的酶解位点是 赖氨酸和精氨酸 因此胰蛋白酶不适合组蛋白的胶内 酶解 其他的蛋白酶 如 Asp N 或 Arg C 也被用于组 蛋白分析中 但是这些酶的胶内酶解效率低 为了克 服这些问题 目前许多实验室在质谱分析前将组蛋白 未修饰的赖氨酸残基或单甲基化的赖氨酸残基用氘醋 47 第 29 卷第 2 期 2012 年 4 月 生 物 学 杂 志 JOURNAL OF BIOLOGY Vol 29No 2 Apr 2012 酸酐进行衍生处理 而后用胰蛋白酶酶解产生合适大 小的肽段进行质谱分析 16 有些实验室也用丙酸酐 进行组蛋白的化学衍生 产生的组蛋白肽很容易用纳 级 LC MS MS 质谱仪分析 14 17 例如 Fischle 等应用 了基于 Bottom up 质谱的分析方法鉴定了组蛋白 H3 上 邻近修饰位点甲基化和磷酸化的生物功能 18 蛋白 质翻译后修饰研究最大的难点在于如何准确鉴定相同 分子上的不同的修饰位点及同一样品中不同分子上的 相同修饰位点 这些修饰彼此间是相互影响的 构成了 调控生物功能的密码 因此 组蛋白修饰研究的焦点 之一是组蛋白翻译后组合式修饰与细胞生物功能的关 系 Bottom up 分析方法需要事先酶解组蛋白成一定 大小的肽段 这将会导致蛋白质不同部分间的连接位 点丢失 从而不能区分蛋白质序列变异体 因此 该方 法不适合分析组合式组蛋白翻译后修饰密码 Middle down 和 Top down 分析方法分别直接分析大片段肽和 完整的蛋白质 19 Middle down 和 Top down 分析方法 中的解离完整蛋白质的方法有两种 分别为电子捕获 解离 electron capture dissociation ECD 和电子转移解 离 ETD electron transfer dissociation ETD ECD 可通 过傅里叶变换仪中的离子回旋共振室对完整的蛋白或 多肽进行离子化 捕获 再与低能量的电子发生反应 这种序列断裂方式是通过在酰胺氮和 碳之间形成 z 型和 c 型的片段离子来对完整蛋白质或多肽 如组蛋 白 测序和定位特异修饰 这样就可以对同一分子内 的复杂翻译修饰进行分析 进而来研究不同修饰间的 相互依赖性 但是基于 ECD 的 Middle down 和 Top down MS 分析方法所需要的质谱仪比较昂贵 限制了 其广泛应用 Hunt 及其同事发明了 ETD 通过从阴离 子自由基到质子肽转移所获得的化学能量将肽碎 裂 20 获得的单电荷和双电荷离子系列可以通过离子 捕获式低分辨率的质谱仪进行分析 如 Thermo Finni gan linear ion trap 线性离子捕获 系统代替傅里叶变 换仪 降低了购置仪器的成本 Middle down 分析方法 需要选择特定的蛋白酶来酶解产生大的肽片段 通常 会选择已知序列的靶标蛋白进行分析 蛋白酶将会有 针对性地酶解靶蛋白产生大的肽片段 例如 GluC 或 AspN Phanstiel 等利用 Middle down 分析方法和基于 ETD 反向 LC MS MS 方法解读了人类胚胎干细胞的组 蛋白 H4 尾部 74 个不同的组合式密码 并且揭示了一 些亚型与多能性之间的相关性 13 Top down 分析方 法通常会对纯化的单个完整蛋白进行分析 该方法有 助于在单个实验中快速地检测到组蛋白的修饰形式 Pesavento 等利用基于 Top down 质谱方法并结合二维 液相色谱定量分析了人类组蛋白 H4 上的组合式修 饰 定量鉴定了 42 个独一无二的修饰形式 21 Jiang 等对酵母的核心组蛋白的组合式翻译后修饰进行了整 体评价 发现 LYS4 的三甲基化与同在组蛋白 H3 尾部 的乙酰化的程度相关联 22 基于质谱的组蛋白分析技术不仅定位和发现新的 修饰 而且还可进行不同状态样品间组蛋白的定量分 析和组蛋白变异体的分析 鉴定 在组蛋白定量方面 可利用质谱无标记方法进行相对定量分析 或用稳定 同位素的体内和体外标记方法进行组蛋白的定量分 析 这对了解组蛋白翻译后修饰与基因表达调控的关 系有着重要的意义 质谱也是鉴定组蛋白变异体的好 方法 组蛋白变异体的存在增加了染色体结构的多样 性 影响着染色质结构 进而调控基因的表达状况 4展望 组蛋白翻译后修饰研究是富有挑战性的研究领 域 随着方法学改进和新技术的出现将有利于推动组 蛋白的研究 质谱技术的应用为染色质生物学研究提 供了新的见解 不仅可以鉴别新的组蛋白修饰及其位 点 组蛋白修饰的定量和组蛋白修饰的组合式研究 这 为解读组蛋白密码提供了有力的工具 ChIP 是一项 组蛋白修饰研究的有力工具 从体内基因组水平上获 得组蛋白修饰信息 该技术是基于质谱技术组蛋白研 究的一项重要的互补技术 随着组蛋白修饰分析技术 及交叉学科的不断发展将有助于研究特定组蛋白修饰 影响特定的转录调控 或是只与基因表达相关 目前 组蛋白修饰的研究主要集中在动物和微生物方面的研 究 关于植物组蛋白修饰研究的报道较少而且起步也 比较晚 例如 在模式植物拟南芥中第一次获得了全基 因组的组蛋白翻译后修饰图谱 23 在大豆组蛋白修饰 研究鉴定到了一些 H3 的变异体 24 在植物的生长发 育或环境因子影响下 组蛋白修饰或变异体的动态变 化研究将有利于进一步了解植物的生物功能 但必须 注意的是 一个特定的修饰功能可能会随着细胞系 细 胞环境和细胞周期等因素而发生变化 因此 随着技 术的改进及结合基因组学和蛋白质组学的方法将有利 于解决生物体组蛋白密码的复杂性 参考文献 1 Strahl B D Allis C D The language of covalent histone modifications J Nature 2000 403 6765 41 45 2 Shogren Knaak M Ishii H Sun J M et al Histone H4 K16 acety lation controls chromatin structure and protein interactions J Sci ence 2006 311 5762 844 847 3 Bannister A J Kouzarides T Reversing histone methylation J Na 57 第 29 卷第 2 期 2012 年 4 月 生 物 学 杂 志 JOURNAL OF BIOLOGY Vol 29No 2 Apr 2012 ture 2005 436 7054 1103 1106 4 Allfrey V G Faulkner R Mirsky A E Acetylation and methylation of histones and their possible role in the regulation of RNA synthesis J Proc Natl Acad Sci USA 1964 51 5 786 794 5 Johnson E M Vidali G Littau V C et al Modulation by exogenous histones of phosphorylation of non histone nuclear proteins in isolated rat liver nuclei J The Journal of Biological Chemistry 1973 248 21 7595 7600 6 Chicoine L G Schulman I G Richman R et al Nonrandom utiliza tion of acetylation sites in histones isolated from Tetrahymen Evi dence for functionally distinct H4 acetylation sites J The Journal of Biological Chemistry 1986 261 3 1071 1076 7 Villar Garea A Imhof A The analysis of histone modifications J Biochimica et Biophysica Acta 2006 1764 12 1932 1939 8 Turner B M Cellular memory and the histone code J Cell 2002 111 3 285 291 9 Bernstein B E Kamal 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