中图版选修一 酶的固定化 课件（49张）.ppt

酶的固定化 主要内容 一 固定化酶的发展简史 二 固定化酶的制备 三 固定化酶的性质 四 固定化酶的应用 什么是固定化酶 水溶性酶 水不溶性载体 水不溶性酶 固定化酶 固定化技术 一 固定化酶的发展简史 固定化酶的定义 是指固定在一定载体上 并能在一定的空间范围内连续的进行催化反应 反应后可以回收重复使用的酶 固定化酶的研究始于20世纪50年代 20世纪60年代发展迅速 1969年 日本首次应用氨基酸酰化酶 1971年 第一次国际酶工程会议 确定了固定化酶的统一英文名称为immobilizedenzyme 1973年 日本人首次工业化应用固定化大肠杆菌中的天冬氨酸酶 由反丁烯二酸生产l 天冬氨酸 1976年 法国人用固定化酵母 啤酒 酒精 1978年 日本人用固定化枯草杆菌生产 淀粉酶成功 1979年 开始了固定化动 植物细胞来获得天然产物 固定化细胞 指固定在载体上 并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞 酶的固定化技术和固定化酶 固定化酶的特点 优点 不溶于水 易于与产物分离 可反复使用 可连续化生产 稳定性好 缺点 固定化过程中往往会引起酶的失活 二 固定化酶的制备 1 1必须注意维持酶的催化活性及专一性 1 2固定化应该有利于生产自动化 连续化 1 3固定化酶应有最小的空间位阻 尽可能不妨碍酶与底物的接近 以提高产品的产量 1 4酶与载体必须结合牢固 从而使酶能回收贮藏 利于反复使用 1 5固定化酶应有最大的稳定性 所选载体不与废物 产物或反应物发生反应 1 6固定化酶成本要底 以利于工业使用 1 制备的原则 二 固定化酶的制备 2 固定化方法概述将酶与水不溶载体结合 制备固定化酶的过程 称为酶的固定化 酶和细胞固定化方法 载体结合法 交联法 包埋法 网格型 微囊型 物理吸附法 离子结合法 共价结合法 热处理 细胞 酶和细胞固定化方法 酶和细胞固定化模式 2 1网格包埋法 网格包埋是将酶包埋在高分子凝胶细微网格中 也称凝胶包埋 常用凝胶 琼脂糖凝胶 海藻酸钠凝胶 聚丙烯酰胺凝胶等 只适用于产 底物都是小分子酶的固定化 天然凝胶在包埋时条件温和 操作简便 对酶活性影响甚少 但强度较差 而合成凝胶的强度高 对温度 ph值变化的耐受性强 但需要在一定的条件下进行聚合反应 才能把酶包埋起来 在聚合反应过程中往往会引起部分酶的变性失活 应严格控制好包埋条件 酶分子的直径一般只有几十埃 为防止包埋固定化后酶从疑胶中泄漏出来 凝胶的孔径应控制在小于酶分子直径的范围内 这样对于大分子底物的进入和大分子产物的扩散出去都是不利的 所以凝胶包埋法不适用于那些底物或产物分子很大的酶类的固定化 而在细胞固定化中 凝胶包理法是应用最广的方法 各种凝胶由于特性不同 它们的具体包理方法和包埋条件也不一样 首先被采用的胶格包埋法是 胰蛋白酶木瓜蛋白酶 淀粉酶 制备方法 enzyme n n 甲叉双丙稀酰胺 丙稀酰胺引发剂 inactiation 2 2微囊包埋法 微囊包埋法 微囊包埋法是将酶包理在由各种高分子聚合物制成的小球内 制成固定化酶 常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜 火棉胶膜等 半透膜的孔径为几埃至几十埃 比一般酶分子的直径小些 固定化的酶分子不会从小球中漏出来 但只有小于半透膜孔径的小分子底物和小分子产物可以自由通过半透膜 而大于半透膜孔径的大分子底物或大分子产物都无法进出 故此 半透膜包埋法运用于底物和产物都是小分子物质的酶的固定化 例如 脲酶 天门冬酰胺酶 尿酸酶 过氧化氢酶等 微囊包埋法制成的固定化酶小球 直径 般只有几 至几百 故称为微胶囊 制备时 般是将酶液分散在与水互不相溶的有机溶剂中 再在酶液滴表面形成半透膜 将酶包埋在微胶囊之中 例如 将欲固定化的酶及亲水性单体 如已二胺等 溶于水制成水溶液 另外将疏水性单体 如癸二酰氯等 溶于与水不相混溶的有机溶剂中 然后将这两种互不相溶的液体混和在一起 加入乳化剂 如司盘 85等 进行乳化 使酶液分散成小液滴 此时亲水性的已二胺与疏水住的癸二酰氯就在两相的界面上聚合成半透膜 将酶包理在小球之内 再加进吐温 20 tween 20 使乳化破坏 用离心分离即可得到用半透膜包埋的微胶囊型的固定化酶 微囊型包埋法和网格型包埋法相比其特点是 优点是 固定化酶颗粒比前者要小得多 比较有利于底物和产物扩散 能容许小分子底物和产物自由出入膜内外 由于囊的表面积相对体积的比值大 故物质交换可以进行得十分迅速 缺点是 半透膜还能阻止蛋白质分子进入和渗漏 注入体内时既可以避免引起过敏反应 同时也可免遭蛋白水解酶的降解 因此其具有较大的医学价值 缺点是反应条件要求高 制备成本也较高 静止法电沉积法反应器上直接吸附法混合浴或振荡浴吸附法 2 3物理吸附法 优点 固定化时酶分子的构象很少或基本不发生变化 缺点 结合力弱 易解吸附 载体 纤维素 琼脂糖 活性炭 沸石及硅胶等 2 4离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法 优点 操作简单 条件温和 酶活力损失少 缺点 结合力弱 易脱落 载体 多糖类离子交换剂和合成高分子交换树脂 第一个离子结合法固定化酶 deae cellulose固定化过氧化氢酶第一个工业化的固定化酶 deae sephadexa 50固定化氨基酰化酶 2 4离子结合法 2 5共价偶联法 共价偶联法 酶以共价键结合于载体的固定化方法 酶与载体之间以共价键结合 优点 结合牢固 不易脱落 缺点 操作复杂 比活力不高 固定化酶难以得到 载体 纤维素 甲壳素 琼脂糖凝胶 葡聚糖凝胶等 2 5共价偶联法 2 5共价偶联法 载体的活化是在载体上引入活性基团 其主要方法有 a重氮法 含苯氨基的水不溶性载体 b迭氮法 含酰肼基团的水不溶性载体 c溴化氰法 含羟基的载体 d烷基化法 含羟基的载体 2 6交联法 交联法 借助于双功能或多功能试剂 使酶分子之间发生交联作用 制成网状结构的固定化酶的方法 优点 结合牢固 缺点 条件激烈 固定化的酶活回收率较低 2 6交联法 双功能试剂 常用的是戊二醛ooh c ch2 ch2 ch2 c h 第一篇报道是 戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间交联的固定化酶 酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子 a 酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶 b 酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶 交联剂戊二醛二重氮联苯胺 2 2 二磺酸4 4 二氟 3 3 二硝基二苯砜二苯基 4 4 二硫氰酸 2 2 二磺酸1 5 二氟 2 4 二硝基苯酚 2 4 二磺酰氯3 甲氧基二苯基甲烷 4 4 二异氰酸盐 常用于固定化酶的交联剂 思考题 比较各种酶固定化方法的优缺点 酶的各种固定化方法的比较 三 固定化酶的性质 大多数情况下 酶经固定化后稳定性提高 主要表现 1 1固定化增加了酶的耐热性 如氨基酰化酶1 2固定化增加了酶对变性剂 抑制剂的抵抗能力 1 3固定化减轻了蛋白酶的破坏作用 1 4固定化可以增强贮存稳定性和操作稳定性 1 固定化对酶稳定性的影响 三 固定化酶的性质 原因 固定化增加了酶活性构象的牢固程度 并且固定化后酶分子与载体多点连接 可防止酶分子伸展变形 固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭 酶活力缓慢释放 抑制酶的自降解 三 固定化酶的性质 一般最适作用随稳定性的增强而升高 如壳聚糖固定的胰蛋白酶最适温度为80度 比游离酶提高了30度 2 固定化酶的最适温度变化 酶固定化后 对底物作用的最适ph值和酶活力ph值常常发生偏离 影响因素 a载体的带电特性 b反应产物的性质 3 固定化酶的最适ph值变化 三 固定化酶的性质 载体带负电 固定化酶的最适ph值较游离酶偏高 载体带正电 固定化酶的最适ph值较游离酶偏低 载体不带电 固定化酶的最适ph值较游离酶不变 原因 载体带负电 则吸收反应液中的h 到其附近 致使固定化酶所处微环境ph值低于周围反应液ph值 这样就必须适当提高反应液ph值 才可以保证酶充分发挥其催化功能 3 1载体性质对最适ph值的影响 三 固定化酶的性质 反应产物为酸性物质 固定化酶最适ph值偏高 反应产物为碱性物质 固定化酶最适ph值偏低 反应产物为中性物质 固定化酶最适ph值一般不变 原因 由于固定化载体的空间阻碍效应 使反应产物的向外扩散受到一定的限制 若产物为酸性 由于扩散障碍 积累在固定化酶所处的区域内 使区域内ph值降低 这样就必须提高周围反应液的ph值 才能达到酶的最适ph值 3 2产物性质对固定化酶最适ph值的影响 三 固定化酶的性质 固定化酶底物特异性的改变 使由于载体的空间位阻引起的 酶固定在载体上后 使大分子底物难于接近酶分子 而使催化速度大大降低 而小分子底物受空间位阻作用较小或不受影响 故与游离酶的作用没有显著差异 4 底物特异性的变化 三 固定化酶的性质 大多数情况下 固定化酶活力比天然酶活力小 专一性也能发生改变 原因 a 空间位阻有所改变 甚至影响了活性中心的氨基酸 b 固定化后 酶分子空间自由度受到限制 会直接影响到活性中心对底物的定位作用 c 内扩散阻力与活性中心的接近受阻 d 包埋时 酶被高分子物质半透膜包围 大分子底物不能透过半透膜与酶接近 5 固定化酶活力的改变 三 固定化酶的性质 固定化酶的表观米氏常数km随载体的带电性能变化 带电荷的固定化载体与底物之间的静电作用会引起底物分子在扩散层和整个溶液之间的分布不均一 由于静电作用 与载体电荷性质相反的底物在固定化酶微环境中的浓度比整体溶液的高 与自然酶相比 这种固定化酶即使在溶液的底物浓度较低时 也可达到最大反应速度 即固定化酶的表观km值低于溶液的km值 而当固定化载体与底物电荷相同时 就会造成固定化酶的表观km值显著增加 6 酶的动力学特征 三 固定化酶的性质 简单说 由于高级结构变化及载体影