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食用菌栽培课件23 第九章菌种的分离 提纯 扩大 培养与保存第一节菌种的分离与提纯 进入课文 菌种的分离 提纯 扩大 培养与保存简介 菌种的分离与提纯是获得一级菌种的途径 菌种的扩大与培养是为了适应生产的需要 扩大菌种数量的过程 菌种的保存 是菌种优良性的保存 是食用菌生产得以不断发展的前提 这些过程的操作都有一个共同的要求 即保证纯培养 纯培养要求无菌操作 下一页 无菌操作规程aspepsisoperationregulations 1任何操作必须在无菌环境下进行 这就要求用空间消毒方法 净化操作环境 达到局部空间消毒所要求的净化程度 2任何操作器具都必须经过消毒处理 尤其是分离 接种的直接用具 3任何一种培养基开口 拨除棉塞 时 都应稍倾斜向下 并在酒精灯火焰附的无菌区域中进行 即火焰封口 操作后棉塞也在火焰上适当燎烤至微焦再塞回 4操作动作要迅速 敏捷 越快越好 第一节菌种的分离与提纯strains separationandpurification 将有价值的子实体的局部或孢子移接在斜面试管培养基上 获得纯培养菌丝的操作称为分离 在分离过程难免出现些杂菌 将所需要的菌丝提取出来称为提纯 下一页 菌种的分离与提纯 一 菌种资源的取得 一 野外标本采集 二 栽培场种菇的选择二 菌种分离 一 分离前的准备 二 组织分离 三 木腐菌基内菌丝分离 四 孢子分离 1 采集的季节collectionseason 大型真菌子实体的形成各有其适宜的季节和一定的生态环境 各地一年四季都有相应的食用菌生长 中温结实性菌类多集中在处暑至白露 谷雨至夏至之间发生 低温结实性菌类在大雪至春分之间出现 处暑前后菌类的种类与数量最多 但常受到处暑前降雨量多寡的影响 使之提前或推迟发生 甚至出现大年小年 2 采集工具collectiontools 标本篮筐 纸质标本盒 白蜡低袋 号牌钢卷尺 手持海拨仪 温度表 指南针 铲 砍刀 手锯 照相机 彩色胶卷 记录卡 蛇伤药 急救外用药及分类参考书 下一页 3 生态环境的了解Understandingentironment 采集标本时 必须注意到菌类的生态环境 特别是要弄清与植被和植物群落组成的种类 菌类分解类型属于腐生 寄生还是共生 与乔木 灌木 草本形成共生菌根的植物名称 土壤结构 土壤有机质成分 酸碱度 土壤质 砂丘真菌 了解采集地的气温 地温 湿度 光照度等 为菌类开发提供原始资料 下一页 4 形态观察与记录configurationobservingandrecording 采集时尽可能采集到完整的子实体 先用彩色摄影将菌类的生态环境 子实体发育的不同阶段拍摄 把标本的形态 大小 颜色 附属物 着生位置详细记录 特别肉质菌类 鲜菇烘干后其色泽 气味 大小 形态都会发生变化 需要注意的是某些菌类的菌盖或菌柄受伤之后易变色 如某些牛肝菌 有的会流出乳汁 乳汁颜色有的还会有变化 有的菌类还具有特殊的气味 下一页 5 采集方法collectionmethod 野外采集时 特别要注意保持子实体各部分的完整 保护容易脱落的菌环 菌托 和鳞片等附属物 有些菌类的菌托半掩埋于土内 有的菌柄在土层内延伸很长的假根 如长根菇 为了采得完整标本 要用小铲挖掘 不能用手拨 以免损坏基部 残缺的标本难以倚做出正确的分类鉴定 对于木腐生菌类 用锯将所采标本的段木锯下 作为分离用的种木 下一页 6 孢子印采集sporemarkingcollection 显微镜下 单个孢子是无色的 但众多孢子聚集在一起 常呈现颜色 这是分类的依据 从中还能看菌褶排列状况 在无菌条件下所获得的孢子印 还可以为杂交育种提供材料 采集孢子印最简单的方法是选用刚破菌膜不久的菇伞 去掉菇柄 静置在纸片上数小时即可 对于多孔菌或革菌类 可在纸片下放置一小杯水 以加快孢子的弹射 下一页 7 鉴定identification 标本采集之后 进行分离之前 先要正确判断其在分类上的地位 才能利用前人的研究成果 也可以从已知的种间亲缘关系 了解其生物学的习性 加快驯化探索的进程 参考书周茂繁 植物病源真菌属分类图索 应建浙 赵继鼎等 食用蘑菇 毒蘑菇 科学出版社邵立平项纯梯等 真菌分类学 中国林业出版社 下一页 8 注意事项attentions 1 最好在同一号标本中能采到不同发育阶段整套标本 研究的个体越多所得出的结果越准确 2 采集后肉质担子菌类的子实体容易变质 腐败 或遭昆虫侵袭 因而进行组织分离 孢子印的采集 标本记录整理 干燥等均应在当晚进行 野外烘烤时炭火温度控制在50 防止烤焦 3 采集的标本供分离的材质含水量过高的标本 可放在通风处 风干一段时间再分离 4 将所采集标本挂上纸牌 相同的标本可采集多份 以便鉴定 分离 浸泡 及干制 下一页 9标本保存samplesaving 1 干制 选择完整具有代表性的子实体 在采集当天于40 60 间歇慢慢烘干 但用此法干菇色泽较差 若有条件可将标本放入风冷式电冰箱的冷藏箱的冷藏架上 经5 左右低温干燥7 10天 标本色泽基本接近原色或不变 干制后标本放入磨口标本瓶内 并同时放入一二粒樟脑丸采集单 封口贴上标签 下一页 2 浸制macerating 标本可分为色素溶于水和色素不溶于水的两种 色素溶于水的配方 醋酸汞1g 中性醋酸铅10g 冰醋酸10ml 90 酒精1000ml 色素不溶于水的配方 1醋酸汞10g 冰醋酸5ml 水1000ml 2硫酸锌2 5g 福尔马林10ml 水100ml 适于保存白色 浅黄色 灰色的子实体 返回 栽培场种菇的选择choosingthegrowthfield 1 种菇 耳 的选择分离对象应从当地当家品种 或从外地引进经大面积栽培后表现出高产 稳产的菌株中选择 最好选择第二潮菇发生初期留种菇 对于群生的菌类 选定留种菇体 应将其四周幼蕾采去 使培养基养分集中供给种菇发育 种菇应选单生 菇盖厚 圆正 菇柄粗短作为留种的对象 种耳应以出耳早 耳片展开完整 耳片厚实 富有弹性为目标 下一页 种菇 耳 采收harvesting 数朵种菇 耳 确定后 各标记号 不断去劣择优 为了搞好分离档案 在未取下种菇 种耳之前 先放好标尺进行彩色摄影 并做好形态记录 采下的菇 用小刀对半切 一半用于分离 另一半置于复印机上复印 可以清晰的子实体结构 作为原始资料保存 下一页 2 成熟度的选择choosingmature 种菇采摘期的选择 不同分离方法对种菇成熟度有不同的要求 采摘期各异 组织分离一般选择幼菇 器官分化尚未结束时采摘 此时菇体正在生长 从最旺盛的 生长点 挑取组织 其菌丝萌发快 长势好 而且操作时 组织块纤维化程度低 容易挑取 孢子分离一般选择器官分化结束后 发育成熟阶段的子实体 有内外菌膜的菇 应选择内或外菌膜将破又未破时 此时孢子接近成熟 胶质耳类在耳片将要失支弹性 垂挂前采摘 返回 菌种分离strainseparation 即是一级菌种的分离 分为孢子分离 组织分离 基内菌丝分离 孢子分离属于有性繁殖的过程 组织分离 基肉菌丝分离属无性繁殖过程 返回 分离前的准备preparationbeforeseparation 1 培养基的选择菌种分离通常使用PDA培养基 此外麦芽浸出汁培养基 麦芽 酵母浸膏培养基也常用 特殊分离培养基常采用相适应的培养基 组织分离的培养基必须选择培养基斜面上无游离的冷凝水 以防细菌扩散 致使分离失败 基内菌丝分离可适当添加抑菌剂 以提高成功率 孢子分离 要求斜面上有少量的游离水以利于孢子吸水萌发 下一页 2 种菇的预处理 种菇采摘后 若种菇水分太高 菇盖沾粘 可适当风干后再进行分离 胶质耳只能用水多次冲洗 无菌滤纸吸干 然后让耳片子实层上重新产生成熟的孢子 供分离 这样可以降低污染率 基内菌丝分离时 其预处理方法是先将腐木风干 后放置在盛有敌敌畏或三氯杀螨醇药剂的密闭容器内过夜杀螨虫 分离前再用酒精灯火焰燎烤数秒钟表面消毒后再分离 返回 1 伞菌组织分离法 操作时 用75 酒精棉球将双手擦洗 在靠近酒精灯火焰附近 双手将被分离伞菌掰开 用火焰灭过菌的解剖刀在菇盖与菌柄交接处划成田字 然后靠近火焰旁用火焰灭过菌的接种针钩取一小块菌肉块 火柴头大小 迅速移入PDA培养基斜面中央 抽出接种针 塞上棉塞 分离操作要小心敏捷 双手不要碰及掰开菇肉中间的任何部位 速度越快越好 菌盖肥厚而体形大换种菇 最好在靠近菇盖外缘菇盖皮菌褶交界处勾取组织进行分离 从个体发育来看 这一部分组织最幼嫩 接种块恢复较快 下一页 2 胶质菌类组织分离法 胶质菌类 白木耳 黑木耳 毛木耳 组织层较薄 具有一定的韧性 不易进行组织分离 一种方法是将耳片反复冲洗 切成0 5 小方块 移入PDA培养基斜面中央 置于28 下进行培养 另一种方法是剖取尚未展开的耳片基团内的组织块进行分离 如银耳 采用耳片组织分离不易获得银耳纯白菌丝体 而采用胶质团耳基内组织进行分离则有可能得到银耳纯白菌丝或纯白菌丝与羽毛状菌丝 香灰菌丝 混合体 下一页 3 菌核的组织分离法 一些药用菌如茯苓 猪苓 雷丸都有菌核 菌核是营养贮藏器官 除少量菌丝之外 大部是多糖类贮藏物质 进行组织分离时选含浆汁多的菌核 在无菌条件下 将菌核剖开 于菌核皮附近 剖取蚕豆大小的菌核组织块移入培养基上 在26 28 培养 如剖取的组织过小 则不易萌发 不易分离成功 下一页 4 特殊的组织分离法 1 生长点分离法适用于菇小 盖薄 柄中空的伞菌分离 如金针菇 在无菌条件之下 用左手拇指和食指夹住菌柄 右手握住长柄摄子 沿着菇柄向菇盖方向移动 去掉菌盖 在菌柄顶端露出弧形白色的生长点 用接种摄子或接种生长点的组织块 移入斜面培养基 培养 下一页 4 特殊的组织分离法 2 菌索分离法适用于蜜环菌 将半干湿的菌索用无菌小刀切断 抽出菌髓 接入培养基 也可以将菌索生长点切断 用无菌水冲洗数次 然后用尖头镊子夹住并插入含氮较高的培养基内 利用菌索厌氧生长的习性 穿入培养基内 当菌索大量繁殖后 击破试管 取出含有菌索的培养基琼脂块移入新的培养基 下一页 4 特殊的组织分离法 3 子实层组织分离法在野外采集时 不少种类往往因菌柄菌肉的内部被虫蛀食一空 有的因菌肉极薄 菌柄中空 而孢子又不易萌发 在这种情况下可以采用子实层分离法 分离时选取未破膜的子实体 钩取菌褶片移入培养基内 一旦菌丝萌发 挑取菌丝尖端部分移入培养基 下一页 5 多孔菌类组织分离法 多孔菌类子实体一般较大 质地较为结实 常以子实体外缘的菌肉作为组织分离材料 如果子实体含水量低 切取5 2 在酒精灯火焰上经5 10秒烘烤 使子实体表面微焦 然后用无菌刀剖取子实体一小块菌肉组织 移入PDA培养基上 含水量大的子实体 稍晾干后再进行组织分离 下一页 6 采用组织分离法的优缺点及注意事项 1 组织分离操作简便 后代不易发生变异 属于无性繁殖 能保持菌株的优良特性 2 此法不仅适合于哪些孢子不易萌发的菌类 也适合于孢子容易萌发的种类 只有胶质类不太适宜 3 本法最大的缺点是感染病毒的子实体进行组织分离时 常得到带病毒的菌丝体 4 种菇或种耳过湿 不能马上进行组织分离 否则易感染细菌 可将之置于纸袋内 放置于5 冰箱内1 2天 待菇体含水量减少时 再进行分离 此法对草菇不适合 返回 从其腐朽林材中分离得到菌丝的方法叫基内菌丝分离法 为了便于分离 在采集标本时先将子实体在菇木上着生位置做好标记 也有个别菌类 如银耳 金耳均非单一菌丝类型 子实体必须靠两种不同类型菌丝混合培养才能形成 称为混合菌丝类型 这两种类型的基内菌丝分离有所差别 下一页 1 单一菌丝类型的基内菌丝分离 野生木生菌多生长在腐朽的段木上 分离时常将腐木成块切下 从腐木上往往可见多种杂菌 杂菌的生长常使腐木块上呈现有颜色的区域和抑制线 根据腐木大小 质地和菌类 推测分离对象发育时间长短 以便确定菌丝大致的分布范围 菌丝生长缓慢的菇种应在靠近子实体着生部位分离 确定分离范围后先将腐木表面消毒 杀螨处理 再按下面步骤 1 把分离用菇木的一部分或全部的表面在火焰上轻燎消毒 下一页 1 单一菌丝类型的基内菌丝分离 2 取小刀在火焰上灭菌 对准种木上菇柄 耳基 的着重位置切成两半 3 确定欲分离菌丝菇木的位置 再次用火焰灭菌过的小刀 在欲分离的部位刻划数个井字 4 用火焰灭菌过的接种钩 钩取一小块木屑 绿豆大小或更小 移接于斜面培养基 5 接种后将试管置于25 27 下培养 促进其恢复 近风干的种木内菌丝常呈休眠状态 接种后 种木吸湿 菌丝逐渐恢复生长 2混合菌丝类型菌种的基内菌丝分离 混合菌丝类型已知的有两种 以银耳为例 银耳的生长发育必须依靠纯白菌丝和羽毛状菌丝的配合 才能生长发育 但两种菌丝生长速度差异很大 纯白菌丝生长速度甚慢 只能在耳基下方分离到 羽毛状菌丝分解能力强 可以在离基较远的地方分离得到 两者分离后 分别再经提纯 配合等一系列过程才能用于生产 下一页 分离步骤separationsteps 1 在标记点上剖开种木块 在耳基附近用火焰灭菌过的接种针挑取砂粒大小木屑 2 将砂粉粒样的木屑 移入无冷凝水的培养基 在23 下培养10余日 如出现绒毛绣球样的白团 即为银耳纯白菌丝 3 剖开种木 在远离耳基处的黑色抑制线附近 用灭菌接种针钩取火柴头大小的木屑颗粒 接入培养基培养 如能很快萌发成羽毛状样并在培养基内产生黑色色素 即为羽毛状菌丝 4 两者分别经提纯 转管扩大和保存 使用时 纯白菌丝经合羽毛状菌丝配合后 接入木屑培养基内 如果出现绒毛团菌丝 并逐渐胶质化 则适合作银耳的栽培种 如果形成淡黄色的胶质团 则适合于代料栽培用种 返回 孢子分离法sporeseparationmethod 孢子分离指利用子实体上产生的成熟的有性孢子获得纯菌种的方法其特点是菌丝菌龄短 生命力强 侵染病毒的菌类可用孢子分离脱毒 可以分为单孢分离 多孢分离 下一页 1 多孢分离sporeseparation 对于一些不易分离的菌种 如胶质菌类 尤以孢子分离最为合适 茯苓栽培中由于菌种菌龄长短对茯苓的影响很大 多采用多孢分离 1 种菇孢子弹射法选择个体健壮 朵形圆正 外表清洁 无病虫害 将要破膜的子实体作种菇 切去菇柄 浸入0 1 升汞水1 2分钟 无菌水冲洗数遍后 用滤纸吸干 下一页 多孢分离multi sporesseparation 在接种箱内将种菇的菌褶朝下 用铁丝支撑置于培养皿放入气灯钟罩下 钟罩 培养皿均需要灭菌 同 钟罩尖顶要事先挫掉 以利通气 如通气不良 罩内这时湿度过大孢子反而不且落下 将培养装置放在已灭过菌的搪瓷盘上 图 静罩12 14小时 就可以看到培养皿内散落一层相应的孢子印 下一页 孢子分离法sporeseparation 用接种环沾取少量孢子 于无菌水试管内稀释 用灭的注射器抽取 在无菌操作的条件下 每支斜面培养基滴几滴 摇散 待孢子萌发后挑取萌发早 长势好的菌落进行转管培养 这种方法麻烦一般很少采用关键点 罩内温度过大 孢子不易落下 尽量控制落下的孢子量孢子印颜色尽可能淡 2 贴褶法plaitingmethod 先用接种针在酒精灯上烧灼 迅速插入斜面培养基前端 冷凝 使部分水蒸汽冷凝到相应的上端试管壁上 形成雾滴 双手将种菇掰开 挑取菌褶贴附于试管内壁试管内壁的雾滴处 利用水的表面张力粘贴住 平卧一段时间 过数小时后 在反光照射下 斜面上可以看到与菌褶大小相应的模糊孢子印 在无菌条件下立即将贴附的菌褶片取出 并滴几滴无菌水 用接种弯钩将孢子摊散开或钩取载有孢子印的小块培养基 移入另一斜面试管进行培养 下一页 2 单孢分离singlesporeseparation 所谓的单孢分离即从收集到的许多孢子中将单个孢子分离出来 分别培养作为育种的材料 单孢子萌发的菌丝为选育优良菌株 品种改良提供机