Keap1-Nrf2通路在防御药物毒性中的防御机制.doc

Keap1-Nrf2通路在防御药物毒性中的调控机制摘 要 药物副作用是公众健康的重要问题。在一些情况下，药物代谢过程中能通过生物活化将母体分子转化为化学活性中间体而产生毒性。为了维持生物活化和解毒之间的良好平衡，哺乳动物细胞演化出可以被诱导的细胞防御系统即抗氧化反应通路。转录因子Nrf2主要通过调控大量II型解毒和抗氧化代谢酶来激活细胞保护通路。然而，Nrf2的活性被细胞质中富含半胱氨酸的Nrf2阻抑蛋白Keap1调控，使得Keap1成为化学/氧化压力的感应器。本文总结了我们现阶段对调控Keap1-Nrf2通路的分子机制，强调Nrf2在防御药物毒性中的重要作用。关键词：Nrf2，Keap1，抗氧化反应元件，细胞防御The Keap1-Nrf2 Cellular Defense Pathway:Mechanisms of Regulation and Role in Protection Against Drug-Induced ToxicityAbstract Adverse drug reactions pose a significant public health problem . In some cases, the process of drug metabolism can contribute to the onset of toxicity through the bioactivation of a parent molecule to a chemically reactive intermediate. In order to maintain a favorable balance between bioactivation and detoxification, mammalian cells have evolved an inducible cell defense system known as the antioxidant response pathway. The activity of this cytoprotective pathway is largely regulated by the transcription factor Nrf2, which governs the expression of many phase II detoxification and antioxidant enzymes. In turn, the activity of Nrf2 is regulated by the cysteine-rich cytosolic inhibitor Keap1, which acts as a“sensor”for chemical/oxidative stress . This article summarizes our current understanding of the molecular mechanisms that regulate the function of the Keap1-Nrf2 pathway and highlights the importance of Nrf2 in the protection against drug-induced toxicity.Keywords: Nrf2, Keap1, Antioxidant response element, Cell defense前 言 药物副作用成为病人发病和死亡的主要原因1，在英国药物副作用是1974到1994年4%药物被撤销的原因2。因此，药物副作用是公众健康的重要问题。在一些情况下，药物代谢过程中能通过生物活化作用产生化学活性中间体，这些化学活性中间体能产生氧化压力或通过共价修饰来抑制重要的细胞大分子功能而产生毒性作用3。外源化合物形成活性中间体是外源化合物的化学特性，目前研究的有害外源化合物包括：环氧衍生物、醌类化合物、羟胺类化合物和呋喃类化合物1。机体抵御外源化合物的毒作用能力通常取决于生物活化和解毒之间的平衡。为了维持生物活化和解毒之间的良好平衡，哺乳动物细胞演化出多方面的、高度调节的细胞防御系统亦称为抗氧化反应通路。抗氧化反应通路通过一系列解毒和抗氧化酶的转录上调，提供了对抗内源的和外源的有害活性物质的保护措施4。三个调控抗氧化反应通路的组成部分是：(1)抗氧化反应元件(ARE)，存在于许多细胞保护基因启动子区域的DNA片段；(2)碱性亮氨酸拉链蛋白家族的转录因子(Nrf2)，与ARE结合的敏感的氧化还原转录因子；(3)Kelch-like ECH-associated protein1(Keap1)，在细胞质内作为Nrf2的负调控蛋白。Keap1揭示细胞对氧化压力的适应性反应的分子机制，对理解决定药物副作用过程和结果的细胞信号传导通路很重要。因此，本文目的是揭示抗氧化反应通路的分子机制，强调Nrf2在防御药物毒性中的重要作用。一 转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)和抗氧化反应元件(ARE) 从氯高铁血红素诱导的红白血病细胞株中取得了一个反转录cDNA文库，然后从cDNA文库中筛选转录因子NF-E2调控蛋白时首次发现Nrf2；不同于在早期红细胞中调控球蛋白基因表达的NF-E2，Nrf2在许多组织中表达；尤其是与解毒有关（肝和肾）和暴露于外界环境（皮肤、肺和消化道）的器官5。与其它CNC家族的转录因子一样，Nrf2的命名是因为它具有capncollar(CNC)类似结构域，Nrf2包括一C-末端的碱性亮氨酸拉链(bZiP)结构，bZiP结构能与其它bZip蛋白形成二聚体并与DNA结合。 通过基因修饰6和电泳迁移率检测（EMSA）7实验，研究证实Nrf2与ARE结合并上调下游目的基因表达。ARE是位于DNA增强子的顺式反应元件，被定义为包含 5-gagTcACaGTgAGtCggCAaaatt-3的序列8。ARE最初是从酚类抗氧化剂-萘黄铜诱导的大鼠谷胱甘肽转移酶2（GSTA2）基因的5上游侧翼序列识别出的41-bp序列9。Nrf2能与包含bZip结构域的小Maf蛋白：MafF、MafG或 MafK结合形成异源二聚体，这个异源二聚体与ARE有高亲和力10。然而，小Maf蛋白缺少转录活性结构域，因此Nrf2-Maf异源二聚体的转录活性依赖于Nrf2转录活性11。小Maf蛋白的过表达通过小Maf蛋白之间结合形成同源二聚体而缺乏转录活性，抑制了Nrf2介导的细胞防御基因的转录7,12, 13。 用鸡的Nrf2蛋白同系物(从红系细胞提取的含有类似于CNC结构域的蛋白)14的结构与人和小鼠的Nrf2蛋白对比，识别出6个高度保守的区域，称之为环氧氯丙烷(epichlorohydrin，ECH)相关蛋白同源结构域(Neh)。Neh1结构域包含保守的CNC和bZip序列片段15，因此Neh1对于Nrf2与小Maf蛋白结合形成异源二聚体及异源二聚体与DNA结合很重要。Nrf2的Neh4和Neh5结构域参与招募转录辅因子16，特别是与环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cyclic AMP response e1ement-binding protein，CREB)结合的蛋白(CREB-binding protein，CBP)17,18；所以Neh4和Neh5结构域对于Nrf2与ARE模序结合并且调控目的基因转录有重要作用。被激活的Nrf2通过上调大量细胞保护基因的表达（表2），来解毒或减小化学/氧化压力使细胞得以生存(图2)。图 1 Nrf2功能性结构域 注：小鼠Nrf2蛋白6个(Neh)功能性结构域。每刻度表示Nrf2蛋白中100 氨基酸，共597氨基酸。表1小鼠Nrf2蛋白功能性结构域结构域功能和特征参考文献Neh2 196包含29DLG31和79ETGE82序列片段(与Keap1结合区域)包含富含赖氨酸的区域(泛素化作用区域)包含DIDLID元件(内环境稳定状况下调控Nrf2降解）15,19,20-22Neh4 111141转录激活区与转录辅因子CBP相互作用17Neh5 172201转录激活区与转录辅因子CBP相互作用包含核输出信号（NES）17,23,24 Neh6 330380在压力状态下调控Nrf2降解20Neh1 427560包含CNC和bZip区域ARE结合区 与其它bZip蛋白(小Mafs蛋白)形成异源二聚体包含核转入和输出信号（NLS、NES）15,25,26 Neh3 561597转录激活区与转录辅因子相互作用27 尽管目前为止Nrf2是CNC-bZip家族中激活ARE最有效的转录因子28,29，Nrf1 30也通过调控ARE介导的基因表达在抵御化学/氧化压力表现出有限的作用6,31,32,33,34。甚至，Nrf1对于胚胎发育很重要，Nrf1/小鼠中胚胎在怀孕1718天死亡35。Nrf1敲除致死的结果至少部分被认为是因为胚胎发育期肝细胞存活下降36。值得注意的是尽管Nrf2不是胚胎发育期所必须的，Nrf1/ Nrf2/胚胎比Nrf1/胚胎死亡更早（怀孕910天），这是由于上升的氧化压力37。这项研究表明了Nrf1和Nrf2在提高胚胎存活方面起到协同作用，进一步强调了ARE转录因子在细胞保护过程中的重要作用。目前，我们对Nrf3在防御细胞压力方面的理解没有Nrf1和Nrf2那么深刻。尽管Nrf3被认为能与MafK形成二聚体并与ARE结合以激活转录过程28，然而Nrf3不在肝脏中表达，而肝脏又是机体内主要的外源化合物代谢和解毒场所38,39。此外，Nrf3的缺失没有表型的改变，至少是没有细胞压力的情况下是如此38,39。因此，Nrf3在抵御细胞压力方面的生理功能仍然不清楚。然而有证据表明Nrf3除了是包括p65型Nrf140，bric-a-brac/tram-track/broad complex(BTB)模序和CNC 同系物(Bach1) 41,42,43；和Bach2 44等蛋白以外的CNC-bZip家族蛋白，可能部分通过与Nrf2竞争结合到ARE上，表现为ARE基因表达的负调控蛋白。未来研究方向将集中在更好理解CNC-bZip家族蛋白的相互作用上的功能和意义。表2 Nrf2下游基因及其功能基因蛋白功能参考文献Aldo-keto reductases(AKR)还原醛和酮类生成伯醇和仲醇45,46Glutamate cysteine ligase, catalytic subunit (GCLC)催化半胱氨酸和L-谷氨酸的结合生成-谷氨酰半胱氨酸47-50Glutamate cysteine ligase, regulatory subunit (GCLM)降低谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）的米氏常数Km（酶促反应的速度为Vmax的一半时的底物浓度）代谢谷氨酸盐，升高代谢谷胱甘肽的反应常数Ki（离解常数，即电离常数又叫电离平衡常数，用Ki表示）47,50,51 Glutathione peroxidases(GPX)以GSH为底物催化H2O2、有机过氧化氢物和脂质过氧化物的还原52,53Glutathione reductase(GSR)催化氧化型谷胱甘肽 (GSSG)还原为GSH54Glutathione synthetase(GS)催化甘氨酸与-谷氨酰半胱氨酸结合55Glutathione S-transferases (GST)降低GSH酸离解常数pKa，催化GSH与亲电试剂结合56-58Heme-oxygenase 1(HO-1)使血红素分解代谢生成胆绿素、一氧化碳和游离铁59,60 Microsomal epoxidehydrolase (MEH)使环氧衍生物和芳烃氧化物与水化合生成极性更强的邻二醇和反式-二氢二醇54,61,62 NAD(P)H:quinone oxidoreductases(NQO)催化孤对电子的还原和醌类化合物的解毒6,63Peroxiredoxin 1 (PRX1)还原 H2O2、过亚硝酸盐和其它有机过氧化氢物64Superoxide dismutases(SOD)催化超氧自由基的歧化作用以生成O2和H2O265Thioredoxins (TRX)催化二硫化物到巯基的可逆还原66,67Thioredoxin reductases(TRX-R) 通过催化硫氧还蛋白活性部位二硫键的还原，重新激活硫氧还蛋白68UDP-Glucuronosyltransferases (UGT)催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA)与亲酯的底物结合69,70图2 Nrf2在药物毒作用方面的保护功能：注：药物经过代谢过程中的生物活化生成化学活性中间体例如醌类、环氧衍生物类和噻吩类。除非经过解毒，否则这些化学活性中间体能通过产生氧化压力或共价结合关键生物大分子包括DNA和蛋白导致毒作用。哺乳动物细胞进化出了通过上调解毒和抗氧化酶来对抗化学压力的感应和应答。这些过程由转录因子Nrf2介导，使Nrf2成为对抗化学活性中间体潜在毒作用，促进细胞存活的重要基因。二、Kelch-Like ECH-Associated Protein 1(Keap1) 在没有细胞压力情况下，Nrf2通过它的抑制蛋白Keap1与Nrf2 Neh2结构域结合锚定于细胞质中15。由于序列类似于果蝇细胞支架结合蛋白Kelch71，Nrf2的抑制蛋白命名为Kelch-like ECH-associated protein 1(Keap1)（图3）。小鼠Keap1蛋白3个主要功能结构域见表3。哺乳动物细胞中Keap1通过与肌动蛋白组成的微丝骨架相互作用而锚定于细胞质中72，并在没有化学/氧化压力情况下抑制Nrf2活性15,73。Keap1的过表达下调Nrf2介导的依赖于ARE的基因的转录15,73,74。在化学/氧化压力情况下，Nrf2逃脱Keap1介导的抑制作用，通过Nrf2的Neh1结构域区的核转入信号（NLS）26在核内蓄积，从而激活依赖于ARE的基因的转录15,73。图3 Keap1结构域注：如图所示小鼠Keap1蛋白3个主要功能结构域BTB, bric-a-brac/tram-track/broad complex；干预区（IVR）, intervening region；双甘氨酸重复区（DGR）, double glycine repeat。每刻度表示Nrf2蛋白中的100个氨基酸。每个半胱氨酸残基均被标示。表3 Keap1结构域的功能和特征结构域功能和特征参考文献BTB 67178Bric-a-brac/tram-track/broad同源二聚体复合物与 Cul3相互作用75-77IVR 179321干预区富含半胱氨酸(6.3% 氨基酸)72,76DGR 322608双甘氨酸（Kelch）重复区与Nrf2相互作用与肌动蛋白组成的微丝骨架相互作用21,22,72,73,78不同于Nrf2，Nrf1在细胞内的定位与活性均不受Keap1调控29,79。值得注意的是Nrf1蛋白比Nrf2蛋白大得多(小鼠Nrf1 741氨基酸对比Nrf2 597氨基酸)，Nrf1大多数比Nrf2多出来的残基位于蛋白N-末端30。一些残基形成了跨膜结构域，锚定Nrf1于内质网29,79，鉴于观察到Nrf1在转录激活形态分子量略小于未激活与细胞膜结合时形态，我们推测Nrf1在内质网应激(ERS)作用下经历了蛋白水解，使其在核内聚集79。因此，Nrf1和Nrf2活性被不同机制调控。三、Keap1-Nrf2通路调控机制尽管Keap1抑制Nrf2是Nrf2受抑制的重要原因，最近研究支持Nrf2的激活机制要比仅仅是从Keap1解离更复杂的观念，并提供了证据。 3.1 Keap1介导的Nrf2泛素化在没有细胞压力时，Nrf2半衰期较短（1030 min）76,80-85。更重要的是，蛋白酶体抑制剂抑制降解使得Nrf2蛋白稳定性提高和提高ARE调控基因转录活性的Nrf2蛋白核内聚集7,49,76,80-88。此外泛素化Nrf2也在没有细胞压力的情况下被检测到7, 77,83,84。这些证据表明Nrf2经过蛋白酶体通路迅速降解，导致Nrf2相对较短的半衰期及在没有细胞压力时的极低表达。 最近研究表明：类似于其它BTB家族蛋白89，Keap1作为依赖Cullin的E3泛素连接酶复合体的底物衔接蛋白39, 76,77, 90。Cullin蛋白(此处为Cul3)充当分子桥，分别结合底物衔接蛋白和底物(此处分别为Keap1和Nrf2)及招募泛素调控蛋白E2的ring-box蛋白Roc1/Rbx191。从建立的细胞系的免疫共沉淀实验揭示Keap1与Cul3的结合39, 76,77, 90,92和Keap1与Roc1/Rbx1的结合，结合位点在Keap1的BTB功能结构域76,77。通过Cul3功能结构域突变或RNA干扰以抑制Cul3功能；结果是降低Nrf2降解及伴随而来的Nrf2基础表达水平升高，最终诱导ARE调控的融合报告基因的嵌合基因76,77,90。Cul3与Nrf2结合，通过依赖于Keap1的机制促进Nrf2降解77,90。复合诱变Nrf2在Neh2结构域中29DLG31和79ETGE82模序的7个赖氨酸残基，有效地禁止了Keap1介导的转录因子Nrf2的泛素化，提高了Nrf2的稳定性（半衰期延长2倍）；分别复原Nrf2赖氨酸残基上的突变后，Nrf2恢复泛素化过程90，表明Neh2结构域的赖氨酸对于Keap1介导的Nrf2抑制很重要。 在化学/氧化压力下，Keap1的泛素化蛋白酶体降解可能对减小Nrf2的抑制有作用92,93。事实上，在暴露于tert-butylhydroquinone (tBHQ )84，依布硒（ebselen）94后观察到高分子量Keap1的形态形成。然而Cys-151的突变能抑制这种现象，表明Cys-151残基在感应促进高分子量Keap1复合物形成的分子中起到重要作用84,94。干预区（IVR）结构域的分子缺失能降低tBHQ暴露引起的Keap1泛素化92，质谱分析结果为Keap1的IVR结构域上的Lys-298残基的泛素化提供证据93。然而，不是所有Nrf2激活剂都诱导高分子量Keap1复合体的形成92-94。因此，在化学/氧化压力下Keap1泛素化应答的重要性还需要进一步探讨。 3.2 Nrf2磷酸化 尽管已经达成磷酸化是调控Nrf2的重要机制的共识，有证据显示一些分子可能通过刺激某种蛋白激酶以诱导依赖于Nrf2的细胞防御通路。大多数研究是通过使用某种蛋白激酶的药物抑制剂来抑制Nrf2的诱导，以此证实磷酸化在调控Nrf2功能上的作用95-100。一个重要观点认为蛋白激酶的抑制无疑对多种信号通路有重要影响，而这些信号通路又可能影响Nrf2体系。一些小分子抑制剂被用来识别调控Nrf2活性的某种蛋白激酶，但这些抑制剂的特异性存在疑问101-103。然而独立研究表明，蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)95, 97,104，细咆外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase-1, ERK1)29和蛋白激酶PKR-like内质网激酶（R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)105能直接磷酸化Nrf2。另外，文献最近报道Nrf2通过酪胺酸激酶（tyrosine kinase，Fyn）在Tyr-568位点的磷酸化是转录因子核内转出所必须的106-109 。化学抑制剂抑制或RNA干扰以耗竭Fyn或其上游调控基因糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase 3，GSK3），均降低Nrf2核转出，提高ARE介导的基因的转录活性106-109。因此，磷酸化是Nrf2激活和减活的重要信号。然而，我们并不明确：特异性诱导剂是否诱导特定的激酶通路，还是依赖于细胞或种属的不同；又或者所有Nrf2激活分子共同特点是诱导多种通路？3.3 Keap1作为还原感应器 除了通过抑制Nrf2的核转入作为Nrf2阻抑蛋白，有证据显示Keap1也能通过它的众多半胱氨酸感应化学/抗氧化压力。人和小鼠所有蛋白中半胱氨酸平均出现频率为2.3%110,然而人和小鼠Keap1蛋白分别包含27和25个半胱氨酸，分别占总量624个氨基酸中的4.3和4.0%。Keap1的许多半胱氨酸残基有较低的酸离解常数(pKa)值。因为Keap1半胱氨酸残基在一个或更多的碱性氨基酸（精氨酸，赖氨酸，组氨酸）的侧面，这些碱性氨基酸使半胱氨酸处于更亲核的硫醇盐的稳定形态111，从而使Keap1有较高的相对反应活性，。尽管诱导细胞防御的诱导剂分子结构各不相同（表4)，但其中很多是亲点试剂112,113，而且几乎所有诱导剂能通过烷基化、氧化或还原来修饰亲核的巯基官能团114。更重要的是，迈克尔受体苯亚甲基烷酮和苯亚甲基环烷酮114及重金属112作为诱导剂诱导细胞保护酶的能力也与它们对巯基的反应活性有关。根据以上证据，我们提出Keap1是寻找已久的化学/氧化压力的“感应器”的假设。表4 Nrf2诱导剂类别例举参考文献烯烃类4-羟基壬烯醛115-118砷类亚砷酸盐/砷酸盐85,119-121Dithiolethiones1,3-二硫-4-硫代羰基五环类奥替普拉（抗吸血虫药物）61,122 烯酮类丙烯醛123,124 异硫氰酸盐1-异硫氰基-4-甲基亚硫酰基丁烷(莱菔硫素)54,125-127 硫醇/二硫化物二硫化二丙烯, 蒜臭素128,129迈克尔受体马来酸二乙酯15苯二酚/醌叔丁基对苯二酚130,131 活性氧/活性氮一氧化氮132-134 定点突变的大量实验揭示一些半胱氨酸的重要作用，特别是Cys-151, Cys-273和 Cys-288残基在Keap1中的作用74, 83,135-137。Keap1的BTB的结构域的Cys-151残基没有表现出是在化学/氧化压力下维持Keap1功能所必须的，但是Cys-151残基对降低Nrf2的抑制和降解起到重要作用83,90,137。因此，Keap1-Nrf2通路感应和应答化学/氧化压力的能力部分依赖于Keap1的Cys-151残基。相反,位于Keap1 IVR结构域的Cys-273和-288是在基础条件下Keap1蛋白的阻遏活性所必需的74,83,135-137。尽管Cys-273或-288的半胱氨酸定点突变为丝氨酸或丙氨酸，没有影响Keap1和Cul3的结合39，然而定点突变致使Keap1蛋白复合体不能直接降解Nrf2，从而抑制转录因子核聚集，最终抑制ARE介导的融合报告基因的嵌合基因的转录74,83,135,136。此外，在表达Keap1 Cys-273/288突变细胞株中Nrf2对诱导剂的应答降低或完全禁止83,136。值得注意的是在IVR, N-末端和C-末端的结构域的其它半胱氨酸突变体对Keap1功能没有影响74,83。因此，根据以上证据Cys-151 , -273和-288对于Keap1的功能很重要，这些残基似乎是Nrf2亲电诱导剂的靶点。 强有力的证据表明通过生物素标记的Nrf2激活分子能直接化学修饰Keap1。15-去氧-(12,14)前列腺素J2 (15-deoxy- 12,14-prostaglandin J2，15d-PGJ2),是有2个亲点的，不饱和羰基的环戊烯酮,是近年来发现的在组织损伤、炎症反应和氧化应激中释放的一种内源性物质。微摩尔浓度的生物素标记15d-PGJ2与Keap1加和，并且激活Nrf2136,138。我们通过质谱识别细胞模型中的特定靶半胱氨酸残基来进一步研究15d-PGJ2对Keap1的修饰139。质谱揭示了N-乙酰-对-苯醌亚胺（N-acetyl-p -benzoquino-neimine，对乙酰氨基酚acetaminophen的肝毒性代谢产物）139，激活硫醇的类固醇地塞米松-21-异烟酸酯（dexamethasone 21-mesylate）139,140，1-氯-2,4-二硝基苯（1-chloro-2,4-dinitrobenzene）139,141，非生物素标记的139和生物素标记的93,142,143碘乙酰胺（iodoacetamide），异硫氰酸盐1-异硫氰基-4-甲基亚硫酰基丁烷（sulforaphane）144和天然化学防护化合物黄腐酚（xanthohumol）、异甘草素（isoliquiritigenin）和10-姜烯酚（10-shogaol）145选择性修饰Keap1的残基。这些扩展性研究表明不存在Keap1某个半胱氨酸优先与所有Nrf2诱导剂反应。这些实验结果可能是特定亲电子试剂与某个半胱氨酸残基的固有反应，或实验方法的略微不同带来的结果，或两者都有。除了我们及Liebler等人最近的结果外93,139,143，以上列举的基于质谱的研究是在体外首先用还原试剂如二硫苏糖醇(dithiothreitol)和三-羧乙基膦（tris-carboxyethyl Phosphine）处理，使Keap1所有半胱氨酸残基没有被亲电试剂修饰，然后用Keap1纯化重组蛋白进行的实验。但是，我们必须指出：尽管人或鼠Keap1 DGR结构域的晶体结构表明在DGR结构域的8个半胱氨酸在没有化学/氧化压力下都不参与二硫键的形成78,146,147，然而Keap1其它的结构域半胱氨酸是否参与二硫键的形成仍然需要讨论。因此，没有对所有Keap1半胱氨酸残基还原形态的鉴别，无法说明这些半胱氨酸残基在体内细胞模型中的形态。另外，由于蛋白折叠、翻译后的修饰和与衔接蛋白的相互作用，体外纯化的Keap1重组蛋白半胱氨酸相关反应活性与细胞中状态可能有显著差异。这些因素可能导致Keap1蛋白在体外多出一些加合作用可能的作用位点，在细胞中被掩盖。同时我们必须考虑到：亲电试剂在细胞中修饰Keap1，必须绕过各种细胞内抗氧化剂和还原剂例如GSH及其它细胞内蛋白。这些细胞内因素掩饰了一些Keap1半胱氨酸的修饰，而在体外半胱氨酸的修饰不被这些因素所影响。因为这些原因，半胱氨酸在体外的残基特异性修饰能在细胞模型中通过生物分析技术证实其有效性就很要了。 任何Keap1蛋白的半胱氨酸残基的修饰可能足以激活Nrf2。Keap1能“感应”能力和应答多种结构不同的分子，这种非特异性激活机制可能是Keap1-Nrf2通路化学性质多样性的基础。具体来说，Keap1关键结构域的单个或多个半胱氨酸残基修饰可能激活Nrf2。事实上，迄今为止每种Nrf2激活分子都被检测到：其优先修饰Keap1 IVR结构域的一个或多个半胱氨酸残基。与以上一致，且值得注意的是1-biotinamido-4-(4-maleimidoethyl-cyclohexanecarboxamido)-butane在体外修饰Keap1在IVR结构域以外的半胱氨酸残基，但不激活Nrf293。总之，这些结果表明Keap1活性半胱氨酸残基中有许多可供选择的靶位点，但这些靶点尤其集中在IVR 结构域。我们的进一步研究应该致力于解释细胞内位于IVR结构域的修饰在激活Nrf2中的重要作用。四、Keap1-Nrf2相互作用模型“Hinge and Latch” 图4 “hinge and latch”Nrf2降解模型概述。注：(a)在细胞压力下,Keap1同源二聚体与Nrf2 29DLG31和79ETGE82模序结合, 将Nrf2定位于泛素有效运转的部位，并直接导致Nrf2蛋白酶体降解。(b)在化学/氧化压力下通过低亲和力29DLG31“锁”的结合可能通过一个或更多半胱氨酸残基的修饰带来的Keap1的构象改变被微扰，然而高亲和力79ETGE82“铰链”的结合依然保留。尽管Nrf2仍然与Keap1结合，Nrf2不在易使泛素运转其上的正确位点上，因此Nrf2不能直接通过蛋白酶体降解。结果，Nrf2与Keap1的结合饱和以至于新合成的Nrf2能在核内聚集，最终激活细胞保护基因的转录活性。有证据显示哺乳动物细胞中Keap1以同源二聚体形式存在21，该二聚体与单个Nrf2结合22,74,75,146。Keap1 BTB结构域是形成同源二聚体所必需的，同时也是抑制Nrf2所必需的75。最近Yamamoto等人提出了“hinge and latch”模型148，这是基于Nrf2 Neh2结构域的2个不同位点：保守的29DLG31和79ETGE82模序，与在Keap1双甘氨酸重复区（DGR）结构域的包含保守的精氨酸、丝氨酸和天门冬酰胺残基的一个重叠位点结合的证据。由于观察到29DLG31和79ETGE82模序与Keap1 DGR结构域有不同亲和力22,149，“hinge and latch”模型提出高亲和力的79ETGE82模序提供了“铰链”通过“铰链”Nrf2可以相对自由的移动。而低亲和力的29DLG31模序提供“锁”，限制了Nrf2靶赖氨酸处于泛素化结合的最佳位置21,22。与以上假设一致的是79ETGE82模序的缺失降低Nrf2和Keap1的相互作用，使得Nrf2稳定表达39,76,150。反之，29DLG31模序的缺失或突变29DLG31模序的残基对Nrf2和Keap1的结合没有影响，但是使Keap1对Nrf2的降解没有直接影响20,21，同时也提高了Nrf2的稳定表达。 尽管化学诱导剂能促进Nrf2的稳定表达和核内聚集，但有证据表明诱导剂没有引起Nrf2从Keap1的解离，也没有削弱Nrf2和Keap1的结合能力84,90,142,135。事实上，这些Nrf2激活分子甚至可能促进Nrf2和Keap1的结合85,93,135，其最可能的理由是Nrf2激活分子降低与Keap1结合的Nrf2降解。值得注意的是：在新蛋白的合成被环己酰胺（CHX）抑制以后，细胞暴露于诱导剂马来酸二乙酯81或tBHQ135中，无法观察到Nrf2的核聚集。以上实验揭示细胞保护应答是新合成的 Nrf2蛋白而不是从Keap1解离的Nrf2介导的。在“hinge and latch”模型中，Nrf2的泛素化在化学/氧化压力作用下降低85,90, 135，这被认为是Nrf2-Keap1-Cul3 复合体的解离造成的。这种解离被认为是通过Keap1富含半胱氨酸的IVR结构域的局部构象改变导致Nrf2 Neh2结构域的靶赖氨酸空间位置不当，造成与Keap129DLG31模序的结合减弱而发生21。尽管这种观念的重要证据还未取得，但最近的报道表明激活Nrf2的分子改变了Keap1构象结构143,151,152和降低Keap1和Cul3的相互作用。Nrf2-Keap1-Cul3蛋白复合体解离以后，Nrf2通过高亲和力79ETGE82模序仍然与Keap1结合，但是Nrf2没有通过蛋白酶体直接降解。这导致Nrf2与Keap1结合的饱和以至于新合成的Nrf2能避免Keap1的作用在核内聚集，最终激活ARE目的基因的转录活性148。参考文献1 Park BK, Kitteringham NR, Maggs JL et al. The role of metabolic activation in drug-induced hepatotoxicity. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2005;45:177-202.2 Jefferys DB, Leakey D, Lewis JA et al. New active substances authorized in the United Kingdom between 1972 and 1994. Br J Clin Pharmacol 1998;45:151-156.3 Park BK. Metabolic basis of adverse drug reactions. J R Coll Physicians Lond 1986;20:195-200.4 Primiano T, Sutter TR, Kensler TW. Antioxidant-inducible genes. Adv Pharmacol 1997;38: 293-328.5 Moi P, Chan K, Asunis I, Cao A et al. Isolation of NF-E2-related factor 2 (Nrf2), a NF-E2-like basic leucine zipper transcriptional activator that binds to the tandem NF-E2/AP1 repeat of the beta-globin locus control region. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91:99269930.6 Venugopal R, Jaiswal AK. Nrf1 and Nrf2 positively and c-Fos and Fra1 negatively regulate the human antioxidant response element-mediated expression of NAD(P)H:quinone oxidore-ductase1 gene. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:1496014965.7 Nguyen T, Sherratt PJ, Huang HC et al. Increased protein stability as a mechanism that enhances Nrf2-mediated transcriptional activation of the antioxidant response element. Degradation of Nrf2 by the 26 S proteasome. J Biol Chem 2003;278:45364541.8 Nioi P, McMahon M, Itoh K et al. Identification of a novel Nrf2-regulated antioxidant response element (ARE) in the mouse NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 gene: reassessment of the ARE consensus sequence. Biochem J 2003;374:337348.9 Rushmore TH, Picket t CB. Transcriptional regulation of the rat glutathione S-transferase Ya subunit gene. Characterization of a xenobiotic-responsive element controlling inducible expression by phenolic antioxidants. J Biol Chem 1990;265:1464814653.10 Itoh K, Chiba T, Takahashi S et al. An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifying enzyme genes through antiox idant response elements. Biochem Biophys Res Commun 1997;236:313322.11 Motohashi H , O Connor T, Katsuoka F et al. Integration and diversity of the regulatory n etwork composed of Maf and CNC f amilies of transcr iption fac tors. Gene 2002; 294:112.12 Dhakshinamoorthy S, Jaiswal AK . Small maf (MafG and MafK) proteins negatively regulate antioxidant response element-mediated expression and antioxidant induction of the NAD(P) H:Quinone oxidoreductase1 gene. J Biol Chem 2000;275:4013440141.13 Dhakshinamoorthy S, Jaiswal AK. c-Maf negatively regulates ARE-mediated detoxifying enzyme genes expression and anti-oxidant induction. Oncogene 2002;21:53015312.14 Itoh K, Igarashi K, Hayashi N et al. Cloning and characterization of a novel erythroid cell-derived CNC family transcription factor heterodimerizing with the small Maf family proteins. Mol Cell Biol 1995;15:41844193.15 Itoh K, Wakabayashi N, Katoh Y et al. Keap1 represses nuclear activation of antioxidant responsive elements by Nrf2 through binding to the amino-terminal Neh2 domain. Genes Dev 1999;13:7686.16 Lin W, Shen G, Yuan X et al. Regulation of Nrf2 transactivation domain activity by p160 RAC3/SRC3 and other nuclear co-regulators. J Biochem Mol Biol 2006;39:304310.17 Katoh Y, Itoh K, Yoshida E et al. Two domains of Nrf2 cooperatively bind CBP, a CREB binding protein, and synergistically activate transcrip-tion. Genes Cells 2001;6:857868.18 Zhu M, Fahl WE. Functional characterization of transcription regulators that interact with the electrophile response element. Biochem Biophys Res Commun 2001;289:212219.19 Katoh Y, Iida K, Kang MI et al. Evolutionary conserved N-terminal doma in of Nrf2 is essential for the Keap1-mediated degradation of the protein by proteasome. Arch Biochem Biophys 2005; 433:342350.20 McMahon M, Thomas N, Itoh K et al. Redox-regulated turnover of Nrf2 is determined by at least two separate protein domains, the redox-sensitive Neh2 degron and the redox-insensitive Neh6 degron. J Biol Chem 2004;279:3155631567.21 McMahon M, Thomas N, Itoh K et al. Dimerization of substrate adaptors can facilitate cullin-mediated ubiquitylation of proteins by a “tethering” mechanism: a two-site interaction model for the Nrf2-Keap1 complex. J Biol Chem 2006281:2475624768.22 Tong KI, Katoh Y, Kusunoki H et al. Keap1 recruits Neh2 through bindi