MM_FS_CNJ_0339 出口食品中弯曲杆菌检验方法.DOC

MM_FS_CNJ_0339出口食品 弯曲杆菌 检验 MM_FS_CNJ_0339出口食品中弯曲杆菌检验方法1.适用范围本方法适用于出口畜肉、禽肉、水产品和牛奶中弯曲杆菌检验。其他出口食品可参照使用。2.主要试剂和仪器2.1.主要试剂（包括培养基）弯曲杆菌增菌肉汤：根据用途，加入1号或2号抗生素溶液制成（A1）；弯曲杆菌分离琼脂（改良Skirrow氏培养基）（A2）；含0.18琼脂的半固体布氏肉汤（A3）；布氏琼脂（A4）；营养肉汤（A5）；中性红溶液（A6）；3过氧化氢溶液；氧化酶试验试剂（A7）；亚硝酸盐检测（硝酸盐还原）试剂（A8）；乙酸铅纸条：将滤纸条浸入饱和乙酸铅溶液中，然后取出，使其干燥；硝酸钾；甘氨酸；氯化钠；盐酸半胱氨酸（cysteine-HCl）；马尿酸钠（sodium hippurate）；萘啶酮酸（nalidixic acid）：每个圆纸片含30g；头孢菌新素（又称先锋霉素I，cephalothin）：每个圆纸片含30g；茚三酮（ninhydrin）；丙酮；丁醇。2.2.仪器微需氧培养设备：最佳微需氧条件为5氧气、10二氧化碳和85氮气，可用具双相压力计的厌氧罐、蜡烛缸、气袋或其他可代用的装置；天平：称量2000g，感量0.1g；均质器；离心机：带50mL离心管；显微镜：相差或暗视野；培养箱：25，37和42；水浴箱：37；注射器：20mL；针头过滤器：滤膜孔隙为0.65m；三角烧瓶：50，250和500mL；平皿：90或100mm；吸管：1和5mL；试管：16mm125mm，带螺旋帽。3.增菌3.1.碎牛肉使用加有按1号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤。称取25g样品，置于均质杯内，加入100mL增菌肉汤。用均质器以800010000rmin均质30s。将均质液通过灭菌纱布，倒入一个容量为250mL的三角烧瓶，置微需氧条件下，42培养2448h。3.2.净膛全禽和分割禽肉在一个灭菌容器中，用250mL灭菌营养肉汤振摇洗涤样品5min。取肉汤，经灭菌纱布过滤，于23000g、4离心20min，或于16300g、4离心30min，弃去上清液，将沉淀物混悬放在250mL的三角烧瓶中的100mL加有按1号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤中。培养方法同3.1条。3.3.牛奶使用加有按1号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤。称取约40g牛奶放入离心管中，按3.2条中的方法离心。弃去脂肪和上清液，将沉淀物混悬放在250mL三角烧瓶内的100mL增菌肉汤中，培养方法同3.1条。3.4.贝类使用加有按2号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤。将100g样品和100mL增菌肉汤放入均质杯中，用均质器以800010000rmin转速均质30s。用灭菌纱布将均质液过滤。取50mL滤液放在500mL三角烧瓶内的200mL增菌肉汤中，培养方法同3.1条。3.5.其他食品所使用的增菌方法决定于食品的种类。虾、整只海鱼和海鱼片经表面洗涤法（3.2条）处理后，用加有按2号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤增菌。羊肉和猪肉块可先用表面洗涤法处理，再用加有按1号配方配制的抗生素的肉汤增菌。碎肉按3.1条所列方法处理。液体食品按3.3条所列方法处理。各种样品的培养方法均同3.1条。4.过程简述4.1.分离和初步鉴定取5mL经2448h增菌的培养物，以0.65m孔径滤膜过滤。取经过滤和未经过滤的增菌培养物，分别在分离用琼脂平板上划线接种，各不少于两个平板。将平皿置微需氧条件下42培养2448h。检查平板上有无透明白色棕黄色（可能出现浅红色）凸起、边缘不整齐、有时沿接种线向外扩散的菌落。挑取典型菌落制作湿片，用相差（或暗视野）显微镜检查，本菌呈现快速的螺旋样运动。涂片作革兰氏染色镜检时，本菌为革兰氏阴性，如小逗点状，两菌体的末端相接时，呈S形、海鸥展翅形或螺旋状。挑取初步鉴定为弯典杆菌菌落，在布氏琼脂上划线作纯分离。培养方法同上。根据生化、生长特性和抗生素敏感性试验进行菌株证实。4.2.证实4.2.1.生化试验从用作纯分离的平板挑选2个典型菌落。从每个典型菌落各挑取一满接种环，分别接种于放在50mL三角烧杯中的4mL布氏肉汤中，置微需氧条件下42培养2448h。同时接种一份已知阳性培养物，以在整个证实试验中作为对照。在大多数情况下，用于生长试验和生化反应的基础培养基是含0.18琼脂的布氏肉汤。这种培养基分装在16mm125mm试管中，每管7mL。从所有布氏肉汤中取出各接种物，滴加0.20.3mL于琼脂表面。4.2.1.1.生长温度试验接种3管含0.002中性红（NR）的基础培养基，其中一管置37培养，检查在这一温度下的生长情况，并用于观察过氧化氢酶反应。另两管分别置42和25培养。每日检查有无生长。对未生长者需培养5d，方可作出时后判断。弯曲杆菌的生长应只限于接近培养基表面的一薄层，广泛的生长不是由于弯曲杆菌属细菌所致。4.2.1.2.过氧化氢酶试验滴加3过氧化氢溶液于显示有细菌生长的试管内，出现气泡者为阳性反应。4.2.1.3.氧化酶试验使用琼脂平板表面经24h培养的生长物（也可取用于抗生素试验的平板）。将氧化酶试剂滴于棉拭子上，并用棉拭子去接触表面生长物。在接触点出现蓝色斑点者为阳性。4.2.1.4.硝酸盐还原试验将供试培养物接种于含1硝酸钾的基础培养基。置空气中于37培养5d。加入亚硝酸盐检测试剂甲液和乙液（A8），出现红色者表明硝酸盐还原成亚硝酸盐，为阳性反应。4.2.1.5.1甘氨酸中生长试验将供试培养物接种于加有NR和1甘氨酸的基础培养基。置空气中于37培养。每日检查有无生长，对未生长者需培养5d，方可作出最后判断。4.2.1.6.3.5氯化钠中生长试验将供试培养物接种于加有NR和3.5氯化钠的基础培养基。置空气中于37培养。每日检查有无生长，对未生长者需培养5d，方可作出最后判断。4.2.1.7.硫化氢产生试验将肉汤培养物接种于加有0.02盐酸半胱氨酸的基础培养基，将一根浸有饱和乙酸铅的滤纸条悬于试管的上部（不让滤纸条接触培养基），旋紧试管帽。置空气于37培养。每日检查，观察滤纸条是否变黑，纸条变黑表明有硫化氢产生，为阳性反应。对未出现阳性反应者需培养5d，方可作出最后判断。4.2.1.8.马尿酸盐水解试验马尿酸盐水解培养基即1灭菌马尿酸钠溶液，可用试管分装，每管0.4mL，冻存备用。用2mm接种环取一满环在琼脂平板上培养过夜的生长物，接种1马尿酸钠溶液中，振摇试管以分散培养物，置37水浴中放置2h。在每个试管中加入0.5mL茚三酮试剂将3.5g茚三酮溶于100mL11丙酮和丁醇的混合物中，将试管于室温下放置2h。出现紫色者为阳性反应。4.2.2.抗生素敏感性试验用灭菌棉拭子将预先准备的布氏肉汤培养物涂布于布氏琼脂平板。将含头孢菌新素（30g）和萘啶酮酸（30g）的圆纸片分别贴于平板表面。置微需氧条件下于37培养24h，检查有无抑菌圈。6.3.根据下表对细菌作出鉴定弯曲杆菌的特性鉴别试验项目弯 曲 杆 菌胎儿弯曲杆菌胎儿亚种空肠弯曲杆菌结肠弯曲杆菌NARTC1)过氧化氢酶氧化酶硝酸盐还原半胱氨酸形成H2S1甘氨酸中生长3.5氯化钠中生长37生长25生长42生长马尿酸盐水解萘啶酮酸试验R2)S2)SR头孢菌新素试验SRRR注：1)NARTC为抗萘啶酮酸嗜温弯曲杆菌。2)R为耐受；S为敏感。5.来源：SN017592附 录 A培养基和试剂（补充件）A1.弯曲杆菌增菌肉汤基础液（布氏肉汤）胰蛋白胨：10.0g蛋白胨：10.0g葡萄糖：1.0g酵母浸膏：2.0g氯化钠：5.0g亚硫酸氢钠（NaHSO3）：0.1g蒸馏水：1000mL将各成分溶于蒸馏水中。121高压灭菌15min。最终pH7.00.2，分装于规格适宜的烧瓶。FBP浓原液。硫酸亚铁（FeSO4）2.5g焦亚硫酸钠（Na2S2O5）：2.5g丙酮酸钠（sodium pyruvate）：2.5g将各成分溶于100mL蒸馏水中，经0.20m滤膜过滤除菌，存于4。每100mL经灭菌的基础液中加1mL，混匀。1号抗生素溶液万古霉素：0.75g三甲氧苄氨嘧啶乳酸盐（trimethoprim lactate）：0.38g多粘菌素B：250000IU将各成分溶于500mL蒸馏水中，经0.20m滤膜过滤除菌。每100mL经灭菌的基础液中加1mL。2号抗生素溶液利福平（rifampicin）：0.2g三甲氧苄氨嘧啶乳酸盐：0.2g多粘菌素B：200000IU放线菌酮（actidione）：2.0g将各成分置200mL容量瓶中，加入95乙醇50mL，振摇使溶解，加入蒸馏水至200mL。过滤除菌，每100mL经高压灭菌的基础液中加1mL。A2.弯曲杆菌分离琼脂（改良Skirrow氏培养基）基础液蛋白胨：15.0g胰蛋白胨：2.5g酵母浸膏：5.0g氯化钠：5.0g琼脂：15.0g蒸馏水：1000mL加热并搅拌使琼脂溶化，121高压灭菌15min。冷至5055，最终pH7.40.2。FBP浓原液：同A1中FBP浓原液，每100mL经灭菌的基础液中加1mL。抗生素溶液：万古霉素：0.5g三甲氧苄氨嘧啶乳酸盐：0.25g多粘菌素B：125000IU蒸馏水：500mL将各成分溶于500mL蒸馏水中，经0.20m滤膜过滤除菌，每100mL经高压灭菌的基础液中加1mL。冻溶脱纤维羊（或马）血将羊（或马）血反复冻融3次，使血球完全溶解，每100mL基础液中加入5mL。混匀后倒入平皿，每皿20mL。A3.含0.18琼脂的半固体布氏肉汤将1.8g琼脂加于1000mL布氏肉汤（A1中基础液），加热并搅拌使琼脂溶化，分装16mm125mm试管，每管7mL。121高压灭菌15min。最终pH7.00.2。A4.布氏琼脂将15g琼脂加于1000mL布氏肉汤（A1中基础液），加热并搅动使琼脂溶化，煮沸1min。121高压灭菌15min，最终pH7.00.2。A5.营养肉汤牛肉膏：3.0g蛋白胨：5.0g蒸馏水：1000mL将各成分加于蒸馏水中，并加热溶解。分装试管时，每管10mL，分装500mL三角烧瓶时，每瓶225mL。121高压灭菌15min。最终pH6.80.2。A6.中性红溶液将中性红2.0g溶于1000mL蒸馏水中，在培养基灭菌前加入，每100mL培养基中加入1mL。A7.氧化酶试剂N，N，N，N四甲基对苯二胺盐酸盐（N，N，N，Ntetramethylpphenylenediamine2HCl）：1.0g蒸馏水：100mL这是一种应首先选用的试剂。将新鲜配制的试液直接滴于琼脂平板或斜面的培养物上。氧化酶阳性菌落显粉红色，并逐渐变紫。宜用幼嫩培养物进行试验，临用时配制试剂，但如果试剂是避光冷藏，可用7d。也可将培养物置于浸透有试剂的滤纸条上。必须用铂丝挑取培养物，用含铁的金属丝会出现假阳性反应。也可用1N，N二甲基对苯二胺盐酸