MM_FS_CNJ_0136 出口肉及肉制品中青霉素残留量检验方法.DOC

MM_FS_CNJ_0136出口肉 肉制品 青霉素 残留量 杯碟法 MM_FS_CNJ_0136 出口肉及肉制品中青霉素残留量检验方法1.适用范围 本方法适用于出口猪、牛、鸡肉中青霉素残留量的检验。2.原理概要 试样中残留的青霉素经用磷酸盐缓冲液抽提，提取液经离心后，取上清液作杯碟法测定。利用被测定样液中的残留青霉素与藤黄八叠球菌作用，产生抑菌圈，用标准曲线法进行定量。用青霉素酶法进行确证试验。3.主要仪器和试剂3.1.主要试剂 磷酸盐缓冲液(pH6.0)：取8g无水磷酸二氢钾和2g无水磷酸氢二钾，用1000mL水溶解，121高压灭菌15min； 青霉素酶(-内酰胺酶)：冷冻干燥品，由国家指定单位提供，并按规定保存使用； 生理盐水：称取8.5g氯化钠，溶解于1000mL水中，121高压灭菌15min。 青霉素标准品：由中国药品生物制品检定所提供，纯度99%，效价一般为1600IU/mg，密封避光，防潮，4冰箱保存； 试验菌种：藤黄八叠球菌(Sarcinalutea)，由中国药品生物制品检定所提供，菌种号28001； 青霉素标准储备液：称取青霉素标准品约20mg(精确至0.1mg)，用磷酸盐缓冲液溶解并稀释定容，得浓度为1000IU/mL的标准储备液。置4冰箱中保存，可使用2天； 青霉素标准工作液：取上述储备液用磷酸盐缓冲液稀释，配制成浓度为0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625IU/mL的标准工作液。当天配制，当天使用； 培养基菌种培养基：见附录A中A1；菌种稀释液：见附录A中A2；营养肉汤：见附录A中A3；基层培养基：同菌种培养基；检定培养基：同菌种培养基。3.2.仪器 培养皿：内径90mm，底部平整光滑，具陶瓦盖； 牛津杯：不锈钢管，外径(8.00.1)mm，内径(6.00.1)mm，高度(10.00.1)mm； 游标卡尺：测量范围0200mm，精度0.02mm； 均质器：转速不低于10000r/min； 离心机：转速不低于4000r/min； 恒温培养箱：搁板必须保持水平； 高压灭菌器； 恒温水浴锅； 绞碎机； 其他：移液管、滴管、试管、离心管、克氏瓶、锥形瓶等。4.试样的抽取与制备4.1.检验批 以不超过2500件为一检验批。 同一检验批的商品应具有相同的特征，如包装、标记、产地、规格和等级等。4.2.抽样数量批量，件最低抽样数，件1251261005101250102515001550110001710012500204.3.抽样方法 按规定的抽样件数随机抽取，逐件开启。每件至少取一袋作为原始样品，原始样品总量不少于2kg，放入清洁容器内，加封后，标明标记，及时送交实验室。如每件中无小包装或有小包装但每袋重量超过2kg者，则可用灭菌刀具在抽出的包件中，每件割取不少于100g，混合后置于清洁容器内，作为混合原始样。混合原始样的总量不少于2kg。加封后，标明标记，及时送交实验室。4.4.试样制备 从取回的原始样品中取出部分代表性样品，将可食部分放入绞碎机中绞碎，充分混匀，用四分法缩分至不少于500g，作为试样。装入清洁容器内，加封后，标明标记。4.5.试样保存 将试样于18以下冷冻保存。注：在抽样及制样的操作过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。5.过程简述5.1.样液的制备 称取40g试样(准确至0.1g)加入80mL磷酸盐缓冲液，搅匀，放置60min，置灭菌过的均质杯中均质2min(9000r/min10000r/min)，经离心30min(4000r/min)，取上清液作为样液。5.2.菌悬液的制备 先将菌种接种于营养肉汤培养基的试管内，经3235培养1824h。移1mL菌液于盛有适量菌种培养基(附录A中A1)的克氏瓶内，使菌液均匀覆盖在琼脂表面，经3235培养1824h。用15mL左右菌种稀释液(附录A中A2)洗下菌苔得菌悬液。置4冰箱保存，可使用2周。5.3.菌悬液用量的测定 在实际测定前，先试几个平板，把不同量的菌悬液加入定量检定培养基中，能使0.0125IU/mL浓度的青霉素标准工作液产生大于10mm清晰、完整的抑菌圈的为最适宜菌悬液用量。一般用量为：每100mL检定培养基中加1mL左右菌悬液。5.4.检定用平板的制备 注入10mL基层培养基于灭菌培养皿内，水平静置，使其凝固。将检定培养基熔化后在水浴锅中冷却至45左右，加入适量从5.3测得的菌悬液，混匀。立即取6mL，注入铺有基层培养基的培养皿中，均匀摊开、凝固。在每个培养平板表面放置6个牛津杯，使牛津杯在半径为2.8cm的圆面成60角间距。所用平板须当天制备。5.5.标准曲线的制备 以0.025IU/mL浓度的标准工作液作为参考浓度。标准曲线上的每个标准工作液浓度取3个检定平板为一组，在每个检定平板上的3个牛津杯内加满参考浓度标准工作液，另3个牛津杯内加满其他浓度的一种标准工作液。参考浓度溶液与标准工作液要间隔放置。5个标准浓度共15个检定平板，含量最低的标准浓度(0.006 25 IU/mL)的3个检定平板作为判断阴性结果的对照，其他12个检定平板用来绘制标准曲线。这样参考浓度0.025IU/mL的标准工作液将得出45个抑菌圈直径的数值，而其他浓度的标准工作液将分别得出9个抑菌圈的数值。 将陶瓦盖盖好，置30培养(171)h。然后翻转平板，除去牛津杯，精确地测量所产生的抑菌圈直径(精确到0.1mm)，求出每组3个检定平板上0.025 IU/mL浓度的抑菌圈直径读数与其他浓度的抑菌圈直径读数的平均值，再求出参考浓度0.025 IU/mL的所有45个抑菌圈直径数值的平均值。用参考浓度的抑菌圈直径的总平均值减去每组平板参考浓度的抑菌圈直径平均值，其差为每组平板的校正值。用来校正其他各标准浓度的抑菌圈读数的平均值。 例如：参考浓度0.025IU/mL的45个抑菌圈直径数值的平均值为15.0mm，而一组3个标准浓度为0.05 IU/mL检定平板中9个0.025IU/mL浓度抑菌直径数值的平均值为14.8mm，则校正值为15.014.80.2mm。如3个检定平板中0.05IU/mL浓度抑菌圈直径数值的平均值为17.0mm，则经校正后的值应为17.2mm。 将这些校准后的值，通过式(1)和式(2)求得L和H点。然后在半对数坐标纸上，以抑菌圈直径为纵坐标(算术级)，以IU/mL计的浓度为横坐标(对数级)，标出L和H点，连成一直线，即为标准曲线。L(3a2bce)/5 (1)H(3e2dca)/5 (2)式中： L标准曲线上最低浓度(0.0125IU/mL)抑菌圈直径，mm；H标准曲线上最高浓度(0.2IU/mL)抑菌圈直径，mm；c参考浓度0.025 IU/mL的45个抑菌圈直径的平均值，mm；a、b、d、e分别表示标准曲线中其他浓度标准工作液(0.0125、0.05、0.1、0.2IU/mL)的抑菌圈直径经校正后的平均值，mm。5.6.样液的测定 每份样液取3个检定平板。在每个检定平板上放置6个已灭菌的牛津杯(按制备标准曲线方法放置)，3个间隔的牛津杯内加满参考浓度青霉素标准工作溶液，另外3个牛津杯内加满被检样液。将陶瓦盖盖好，置30培养(171)h。然后翻转平板，除去牛津杯。如有抑菌圈产生，精确测量其直径。如样液的测定结果，抑菌圈直径10mm时，尚需作确证试验，以证明抑菌物确系青霉素。5.7.确证试验 取青霉素酶用灭菌生理盐水稀释摇匀，使浓度为1.0106 IU/mL。将此稀释液以119的体积比例加到样液中，于36作用30min。用3个检定平板，每个平板中，两个牛津杯内加0.025 IU/mL参考浓度标准溶液，两个牛津杯内加未经酶处理的样液，剩余两个牛津杯内加经酶处理过的样液，按以上方法于30培养(171)h。如经酶处理过的样液无抑菌圈，而未经酶处理过的样液仍有抑菌圈，则说明样液中抑菌物确系青霉素，否则为非青霉素。6.结果计算 如样液抑菌圈的直径10mm，即报告为“未检出”。如抑菌圈的直径10mm，经校正后，从标准曲线上查出相应的以IU/mL计的青霉素含量，乘以转换系数2，即得以IU/g计的青霉素含量。按式(3)计算试样中青霉素的含量：Xc(3)m式中：X试样中青霉素的含量，IU/g；c从标准曲线上查出的样液中相应的青霉素浓度，IU/mL；m每毫升最终试液所代表的试样量，g。注：如试样中青霉素含量以mg/kg表示时，可将式(3)计算得的X值乘以1 000/t，t为青霉素标准品(纯度99%)以IU/mg计的效价。7.低限和回收率测定7.1.测定低限 本方法的测