UPLC-MS法测定丹参药品中水溶性成分含量

测定丹参药品中水溶性成分含量 摘 要： 传统中药丹参，是著名抗衰老中药。本文介绍了丹参的作用、主要成分及用途，并对丹参国内外研究现状及趋势进行了阐述，还介绍了高效液相色谱 中药含量测定中的应用以及中药材在含量测定时的指标成分选择。我参考有关文献采用 测定复方丹参片、复方丹参滴丸、丹参注射液中三种水溶性成分迷迭香酸、原儿茶醛、丹酚酸 B 的含量，采用色谱柱 100 .1 以甲醇 甲酸 为流动相进行梯度洗脱，流速为 过质谱解析以及与对照品比较，运用质谱仪定性分析丹参中各种水溶性成分，并建立了 析方法同时测定这三种成分的含量。 该方法操作简便、灵敏度高、重现性好，为丹参中药制剂质量标准的研究提供实验依据。 关键词 ： 丹参药品；高效液相色谱质谱联用；水溶性成份 is of of is in of P MS in of in of in P MS is to of in , 00 mm x 2.1 1.9 mu m as 1 by of of to of is to of CM to 录 摘要 x x 第一章 前言 x 1 本论文内容 x 2 研究的目的 x 究的背景和意义 x 究的创新点及难点 3 丹参概述 x 参的介绍 x 态特征 境分布 学成分 参的功效 及 作用 x 参的发展及研究现状 x 4 主要成分提取和分离的方法 x 提法 x x 速逆流色谱法 x 声波提取法 x 5 丹参有效成分的测定方法 x 层色谱法 x 外分光光度法 x 相色谱法法 x 效液相色谱法 x 效液相色谱 质谱联用概述 x 相色谱 x 相色谱 x 相色谱 x 6 x 知化合物定性分析及结构鉴定中的应用 x 知成分定性分析中的应用 x 物代谢中的应用 x 第二章 实验部分 x 1 仪器与试剂 x 器 x 剂 2 方法 x 件的选择 x 谱条件 x 谱条件 x 速的选择 x 子化模式 的选择 x S 条件的选择 x 量离子对的选择 x 照品溶液的制备 x 品溶液的制备 x 法学考察 x 性关系试验 x 密度 x 复性 x 定性 x 标回收率 x 品含量测定 x 3 结果与讨论 x 4 展望 x 结论 x 参考文献 x 致谢 x 第一章 前言 1 本论文内容 传统中药丹参为唇形科植物丹参 的干燥根及根茎，是著名抗衰老中药。近代已从中分离得到多种化学成分，含有酚酸类水溶性成分和二萜类脂溶性成分两大类，水溶性成分有原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸 B 等。丹参的水溶性成分不仅具有显著的抗氧化、抗自由基、抑制低密度脂蛋白氧化的特性。而且具有护肝、抗肝癌、抗心血管疾病以及抑制 毒对宿主细胞的感染等作用。最近研究发现丹参水提物和丹参素促进成骨细胞活性和防治泼尼松所致大鼠骨质疏松。 本实验旨在测定丹参中水溶性成分含量， 丹参药品的主要水溶性成分为迷迭香酸、原儿茶醛、丹酚酸 B 等，我参考有关文献采用 测定丹参药品中迷迭香酸、原儿茶醛、丹酚酸 B 的含量， 用有效的方法提取和分离丹参主要水溶性成分， 采用色谱柱是 100 .1 甲醇 甲酸 为流动相进行梯度洗脱，流速为 建 立和优化高效液相色谱条件，拟合和优质质谱条件。 主要包含以下几方面的内容： 丹参中主要成分的提取；丹参主要成分色谱、质谱分离条件的拟合和优选；定性定量模式以及定性定量离子对的确定；分析方法的建立，以及所见分析方法的表征，即回归方程、相关系数、精密度、稳定性，检出限以及加标回收率的测试等。 2 研究的目的 究的背景和意义 丹参是常用中药材之一，也是许多中成药组方中的常用品种，丹参全国需求量较大，是临床上最常用的药物之一，在中药材中占有重要地位，丹参不仅有活血化瘀的作用，而且对治疗冠心病、肝炎、脉管炎及神经衰弱等多种疾病均有新的疗效，还有相当数量的出口，近年来研究发现用来治疗心血管疾病 , 疗效显著。以丹参为原料生产的复方丹参滴丸、丹参舒心胶囊、丹参片、丹参膏、丹参霜等产品近百种；生产剂型有浓缩丸、胶囊剂、片剂、注射剂、冲剂等 10 多种。所以丹参的开发与利用有很好的发展前景。但由于丹参的野生资源日趋减少，远不能满足临床需求量，因 此丹参的栽培品种发展很快。丹参药材以及制剂的质量控制研究已成为丹参研究的热点， 而丹参有效成分的多样性一直是丹参药材质量控制的难点， 寻找有效准确方便的质量控制方法是研究的根本目的。此外，丹参适应性较强，对外界环境的要求不甚严格种植技术难度不大，适合种植的土地面积较多，生产和市场潜力很大，所以栽培丹参前景广阔，可产生较大的经济效益。所以研究丹参的有效成分对现代医学的发展有重要意义。 究的创新点及难点 作为中国传统中药， 现代丹参的化学成分以及药理学研究已经十分透彻。现代将丹参的化学成分分为 二萜醌类、 酚酸类及其他类 3 个类型的化合物。其具药理活性的主要为二萜醌类、 酚酸类即脂溶性和水溶性成分。水溶性的成分主要为酚性化合物、 多糖和糕质，其中具有活性的成分主要是丹酚酸类化合物、 丹参素和迷迭香酸， 具有抗肝纤维化、 保护脑缺血、 抗动脉粥样硬化以及抗氧化等作用。丹参药材以及制剂的质量控制研究已成为丹参研究的热点， 而丹参有效成分的多样性一直其丹参药材质量控制的难点， 寻找有效准确方便的质量控制方法是研究的根本目的。 创新点：（ 1）本研究课题建立的检测方法，集合了高效液相色谱法的高分离能力和质谱法 的高灵敏性，定性定量的完成。（ 2）我查阅有关文献没有找到高效液相色谱 儿茶醛和丹酚酸 B 的研究，这是本课题选取的创新点。（ 3）用高效液相色谱 利于丹参的质量控制。 难点：（ 1）如何有效的提取和分离丹参主要水溶性成分是本研究课题的主要难点之一。（ 2）丹参的主要成分比较复杂，含有脂溶性成分和水溶性成分，而如何成功的使得有效成分达到基线分离，即建立和优化其高效液相色谱条件，以及如何拟合和优质质谱条件和离子化模式的选择是本研究课题的难点 。 3 丹参概述 参的介绍 中药丹参是唇形科鼠尾草属的多年生草本植物丹参 ( 的干燥根及根茎，因其色红且形状似参而得名 “丹参” ,又名：紫丹参，红根，血参，大红袍等。以根用药。丹参作为传统中药在我国沿用已久 ,始载于我国古代神农本草经 ，被列为上品。本草经疏 、本草纲目 中都有记载。其味苦，性微寒，归心、肝二经。 态特征 丹参为唇形科鼠尾草属的多年生直立草本，高约 3580多分枝。根圆柱形，肉质，外面砖红色，内部乳白色。 茎直立 ，方形，表面有浅槽。单数羽状复叶，对生， 有柄 ， 叶柄长 叶 37 片 ，顶端小叶最大，小叶柄亦最长，侧生小叶短柄或无柄；小叶片卵形、广披针形， 长 宽 14伞花序 6 至多花 ，总状花序，顶生或腋生， 长 1020花轮生， 每轮有花310 朵， 小苞片披针形 ， 长约 4花萼钟形 ， 带紫色 ， 长钟状 ， 长 1端二唇形 ， 上唇阔三角形 ， 先端急尖 ， 下唇三角形 ， 先端二尖齿裂 ， 萼简喉部密被白色长毛 ， 能育雄蕊 2， 着生于下唇的中下部药隔长 型果椭圆形； 花冠蓝紫色 ， 二唇形 ， 长约 唇直升略呈镰刀形，下唇较短，圆形。花期 59 月，花后见果。种子发芽率低，一般不采用种子繁殖。 境分布 生于海拔 1201300m 的山坡、林下草地或沟边。生于海拔 21004050m 的林缘、路旁、沟边灌丛中。丹参分布于辽宁、河北、河南、山东、山西、江西、安徽、江苏、浙江、湖北、甘肃、贵州、四川、陕西、甘肃、广西等地，主产安徽、山西、河北、四川、江苏等地。此外，湖北、甘肃、辽宁、陕西、山东、浙江、河南、江西等地亦产。野生的丹参常见于山坡、草丛、林下、溪谷旁。目前野生丹参资源由于过度采收已遭破坏，各地虽有栽培品种，但品质退化严重，质量参差不齐。 学成分 丹参主要含两类成分 : 一类为脂溶性的二萜类化物，二类为水溶性的多聚酚酸类成分。 20 世纪 3060 年代，有效成分的研究重点为丹参 的脂溶性成分。而在 80 年代，姚俊严等从丹参中提取分离出原儿茶醛，至此人们开始把研究重点转移到水溶性成分，且发现丹参的主要活性成分为水溶性酚酸。 丹参脂溶性成分： (1) 邻醌型丹参酮类二萜化合物在丹参中含量较高 , 有较强的生理活性 ,是丹参主要有效成分之一。主要有 :丹参酮 、丹参酮 A、 B 、 隐丹参酮、丹参酸甲酯、紫丹参素等。其中丹参酮 A 是丹参治疗冠心病的主要有效成分之一 ,在丹参中的含量可达 上 ,将其磺化制成丹参酮 A 磺酸钠后 ,可增加水溶性及提高药理活性。隐丹参酮抗菌活性很强 ,比小檗碱强许多倍 , 含量亦高 ,常作为抗菌消炎类丹参制剂的质量控制指标成分。 (2)对醌型的丹参酮类二萜化合物在丹参中含量很低 ,主要有 :异丹参酮、异丹参酮 ,异隐丹参酮等。 (3) 其它二萜类化合物较少 , 含量低。主要有丹参螺旋内酯、 新隐丹参酮等。醌类、酚酸类及其他 3 个类型的化合物。其具药理活性的主要为二萜醌类、 酚酸类即脂溶性和水溶性成分。水溶性的成分主要为酚性化合物、多糖和糕质，其中具有活性的成分主要是丹酚酸类化合物、丹参素和迷迭香酸。 丹参水溶性成分： 丹参酸（丹参酸 A 又称丹参素，）乳酸，丹参酸 B 是由 3 分子的丹参素和1 分子的咖啡酸缩合形成的，就是丹参酚酸 B；丹参酸 C 是 2 分子丹参素的缩合物；丹参酚酸；迷迭香酸，迷迭香酸甲酯，紫草酸单甲酯，紫草酸二甲酯，紫草酸乙酯，紫草酸，原儿茶醛，咖啡酸，异阿魏酸等。还含黄苓甙，异欧前胡内酯，熊果酸， 萝卜甙， 呋喃甲醛，替靠皂甙元，豆甾醇等。 参的功效及作用 丹参味苦、微辛，性微寒；心、脾、肝、肾血分之药；具有 活血调经，祛瘀止痛，凉血消肿 ，清心除烦，养血安神 的 功效 。主治月经不调，经闭痛经， 产后瘀痛 ， 症瘕积聚，胸腹刺痛， 风湿痹痛，症瘕结块， 热痹疼痛，疮疡肿痛，心烦不眠， 肝脾肿大，心绞痛 等 。 丹参水溶性成分主要有原儿茶醛、迷迭香酸、丹参素、咖啡酸、丹酚酸等，均具有抗心肌缺血缺氧作用，丹参素和原儿茶醛在丹参体内含量较高 ,活性较强，是丹参治疗冠心病的主要有效成分之一，常作为丹参原药材和丹参制剂的质量控制指标成分。近期研究发现 :丹酚酸 A 和丹酚酸 B 的抗心肌缺血缺氧的活性比丹参素和原儿茶醛更强，其中丹酚酸 还具有改善记忆、降低抗癌药阿霉素毒性等作用。 具体作用体现在： (1) 活血 能扩张冠状动脉，增加冠脉流量，改善心肌缺血、梗塞和心脏功能，调节心律，并能扩张外周血管，改善微循环；缩短红细胞及血色素的恢复期，使网织细胞增多，能促进组织的修复，加速骨折的愈合； (2) 能提高机体耐缺氧能力 (3) 预防血栓 有抗凝血，促进纤溶， 提高纤溶酶活性 ； 延长出、凝血时间 ， 抑制血小板凝聚，抑制血栓形成的作用； (4) 降血脂 能降低血脂，抑制冠脉粥样硬化形成； (5） 护肝 能抑制或减轻肝细胞变性、坏死及炎症反应，促进肝细胞再生，并有抗纤维化作用；另外，对结核杆菌等多种细菌有抑制作用； (6) 抗肿瘤 能有中枢神经有抑制作用；有抗肿瘤作用； (7) 能增强机体免疫功能 (8) 促进组织的修复与再生 丹参制剂治疗 坏死心肌清除快 、 纤维母细胞分化、胶原纤维形成较明显 ； 肉芽形成比较成熟。局部淤血减轻、血液循环改善，愈合时间缩短 。 (9) 降血糖 能降低血糖。 参的发展及研究现状 随着丹参市场的扩大、需求量的剧增，野生丹参资源已远远不能满足市场的需求 ,而栽培资源只种不选的状况又使各地产丹参质量参差不齐，品质退化严重，有效成分含量低。丹参制剂品种繁多，但是质量大多不稳定，有很多潜在的风险。 4 丹参主要成分提取和分离的方法 提法 醇提法 ( 将被提取的物质放入醇中，引入超声波，超声振动一定时间后，将固体物滤出，醇溶液即为提取液 。 兰小艳等研究以乙醇为溶剂提取杜仲叶中绿原酸的最佳工艺条件。通过单因素实验研究各因素对提取率的影响，应用正交实验优化工艺条件。乙醇提取杜仲叶绿原酸最佳工艺条件为：乙醇浓度为 60%，浸提温度为 60 ，时间为 料比为 1:12。在最佳提取条件下绿原酸提取率为 临界流体萃取技术 临界萃取（ 是80 年代以来迅速发展的一项新型化工分离技术。超临界 取分离过程的原理是利用超临界 某些特殊天然产物具有特殊溶解作用，利用超临界 利用压力和温度对超临界 解能力的影响而进行的。在超临界状态下，将超临界 待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。当然，对应各压力范围所得到的萃取物不可能是单 一的，但可以控制条件得到最佳比例的混合成分，然后借助减压、升温的方法使超临界流体变成普通气体，被萃取物质则完全或基本析出，从而达到分离提纯的目的。 李霞等采用单因素法及正交法试验优化了超临界萃取条件，并选取了不同的夹带剂乙醇萃取丹参活性成分，经过筛选，最后选用 950 醇为夹带剂，压力为 20 度为 45的条件萃取了丹参酮类脂溶性物质之后，药渣又采用 100 醇为夹带剂，压力为 30度为 65 萃取了丹参酚酸类水溶性物质。同时与传统回流提取法及超声提取法进行了比较，结果表明 超临界流体萃取法提取的化合物种类最多，超声提取法次之，回流提取法最少。进行电场强度梯度递增处理，同 时进行裂解碎片的多级（ 5 级 ） 质谱分析并结合对照品及相 关文献可初步确定其中的 15 种成分。 速逆流色谱法 高速逆流色谱法 ( 1982年由美国国立卫生院 士研制开发的一种新型的、连续高效的液液色谱分离技术。它不用任何固态的支撑物或载体，它的固定相和流动相都是液体，利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡。由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，不仅能使样品全部回收且回收的样品更能反映其本来的特性，是一种理想的制备分离手段。 钱骅等以栀子苷粗提取物为原料，采用高速逆流色谱法分离栀子苷，溶剂系统为 A：乙酸乙酯 水（ 2 : 3）和 B：正丁醇 1:1），上相为固定相，下相为流动相，流速为 速为 850r度控制在 25 ，纯度用 定。结果表明，利用溶剂系统 A 和 B 进行 备栀子苷，使栀子苷含量从 分别提高至 和 。 声波提取法 超声波提取法（ 采用超声波辅助溶剂进行提取，声波产生高速、强烈的空化效应和搅拌作用，破坏植物药材的细胞，使溶剂渗透到药材细胞中，缩短提取时间，提高提取率。 可作生物和植物细胞破碎；可作生物和植物有效成份萃取；可作中草药有效成份的低温提取。 提取效率高，提取时间短，提取温度低，适应性广（超声提取中药材不受成分极性、分子量大小的限制，适用于绝大多数种类中药材和各类成分的提取）和提取药液杂质少，有效成分易于分离、纯化等。 赵熙 等采用正交试验设计 ,对超声波法提取茶叶中总黄酮的工艺条件进行了优化 ,并与传统醇提法进行比较。结果表明 :超声波提取法可以明显提高茶叶总黄酮得率 ,乙醇浓度和提取次数对超声波提取影响达到极显著水平 (P液固比的影响达到显著水平 (超声波提取茶叶总黄酮的最佳工艺为乙醇浓度 90%,提取次数 2 次 ,液固比 40:1。与传统醇提法相比 ,茶叶总黄酮得率提高了 5 丹参有效成分的测定方法 层色谱法 薄层色谱法 (一种吸附薄层色谱分离法，以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。它利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使在移动相流过固定相的过程中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而达到各成分的互相分离的目的。薄层色谱法是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术。 李静等 应用高效薄层扫描法对丹参根中的原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸及其甲酯、丹酚酸 A,B 和 有效成分进行了含量测定。选择了最佳提取分离方法 ,即生药用热水提取并酸化后用乙酸乙酯萃取 ,萃取液浓缩后进行薄层色谱分离。展开剂 A：氯仿 苯 :1:离原儿茶醛 ,展开剂 B：氯仿 苯 2:1 : 1 : 离其余 6 种成分。并用所建立的分析方法分析比较了 4 种丹参根中 7 种有效成分的含量。 外分光光度法 紫外分光光度法（ 根据物质分子对 波长 为200760量和结构分析方法。操作简单、准确度高、重现性好。波长长（频率小）的光线 能量 小，波长短（频率大）的光线能量大。 李龙健等建立薄层层析 法：以原儿茶醛为对照品，二氯甲烷 甲酸 (8:5:展开剂，分离得到原儿茶醛，采用紫外分光光度法，检测波长 281定原儿茶醛的含量。结果：原儿茶醛在 g围内线性关系良好， r=。平均含量为 mg样回收率为 结论：实验结果表明，薄层层析 法操作简便、准确度高、精密度好，可用于丹参注射液的质量控制。 相色谱法 气相色谱法 (用气体作为流动相的色谱法，根据固定相状态不同分为气固色谱和合气液色谱。气固色谱采用多孔性固体为固定相，分离的主要对象是一些气体和低沸点的化合物。气液色谱多用高沸点的有机化合物涂渍在惰性载体上作为固定相，一般在 450 以下，有 10蒸气压且热稳定性好的有机及无机化合物都可用气液色谱分离。气相色谱法是分离分析中最重要的方法之一，所有的柱子绝大部分为毛细管柱，它分离能力强、选择性好、灵敏度高、操作简单。但气相色谱法测定有机酸时，常因酸的沸点较高、不易气化而需要对其衍生再进行测定，方法繁琐。 徐新军 等 建立隐丹参酮原料中乙醇、乙酸乙酯和二氯甲烷残留量的测定方法。方法采用毛细管 气相色谱法，用 细管色谱柱和氢焰离子化检测器，以 N， 丙醇为内标，程序升温法测定溶剂残留量。结果乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷线性范围分别为 r= r=0 9992）、 r=平均回收率分别为 、 、 ；检测限分别为 300ng20ng560ng论该法灵敏、准确，适用于隐丹参酮原料中的溶剂残留量测定。 效液相色谱法 高效液相色谱法（ 是 色谱法 的一个重要分支，以 液体 为 流动相 ，采用高压输液系统，将具有不同 极性 的单一 溶剂 或不同比例的 混合溶剂 、缓冲液等流动相泵入装有固定相的 色谱柱 ，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对 试样 的分析。 高效液相色谱法分离效率高，选择性好，检测灵敏度高，操作自动化，应用范围广且不受试样的挥发性和热稳定 性限制，流动相种类多，可通过流动相的优化达到高的分离效率；但高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”，在进样到检测器之间，若流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰加宽，柱效率降低。且灵敏度不太高。 典灵辉 等 建立高效液相色谱法测定丹参提取物中水溶性成分丹参素、原儿茶醛和丹酚酸 法为高效液相色谱梯度洗脱法。色谱柱为 谱柱（ 2505m）；流动相为 1 冰醋酸溶液（ A）和甲醇（ B）梯度洗脱；检测波长为 281速为 温为 25 。结果发现丹参素、原儿茶醛和丹酚酸 B 线性范围分别在 r加样回收率分别为 ， ， 。结论该方法操作简便、灵敏度高、重复性好，可用于丹参提取物质量控制。 效液相色谱 质谱联用概述 相色谱 液相色谱 简称液相色谱与质谱联用的仪器。 以质谱仪为检测手段，集 S 高灵敏度和高选择性于一体的强有力分离分析方法。特别是近年来，随着电喷雾、大气压化学电离等软电离技术的成熟，使得其定性定量分析结果更加可靠，同时，由于液相色谱 挥发和热不稳定化合物的分离和鉴定具有独特的优势，因此，它已成为中药制剂分析、药代动力学、食品安全检测和临床医药学研究等不可缺少的手段。 液相色谱（ 够有效的将有机物待测样品中的有机物成分分离开，而质谱（ 够对分开的有机物逐个的分析，得到有机物分子量，结构（在某些情况下）和浓度（定量分析）的信息。强大的电喷雾电离技术造就了 期数据处理简单的特点。 有机物分析实验室，药物、食品检验室，生产过程控制、质检等部门必不可少的分析工具。 相色谱 1977 年， 始投放市场； 1978 年， 次用于生物样品中的药物分析； 1989 年， 得成功； 1991 年， 于药物开发；1997 年， 于药物动力学筛选； 1999 年， 放市场，大气压离子化接口的应用，彻底改变了面貌，使其迅速成为制药工业中应用最广的分析仪器。 相色谱 液相色谱质谱联用仪特点：液相色谱和质谱连接，可以增加额外的分析能力，能够准确鉴定和定量像细胞和组织裂解液，血液，血浆，尿液和口腔液等复杂样品基质中的微量化合物。高效液相色谱质谱系统（ 供了一些独特的优势，包括：快速分析和流转所需的最少样品准备 ,高灵敏度并结合可分析多个化合物能力，甚至可以跨越化合物的种类 ,高精确度，高分辨率鉴定和量化目标分析物。 优点：（ 1）分析范围广， 乎可以检测所有的化合物：不挥发性化合物、极性化合物、热不稳定化合物、大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定。（ 2）分离能力强，即使被分析混合物在色谱上没有完全分离开，但通过 特征离子质量色谱图也能分别给出它们各自的色谱图来进行定性或定量。（ 3）定性分析结果可靠，可以同时给出每一个组分的分子量和结构信息。（ 4）检测线低， 备高灵敏度，通过选择离子检测（ 式，其检测能力可以提高一个数量级以上。（ 5）分析时间快， 用的液相色谱柱为窄径柱，缩短了分析时间，提高了分离效果。（ 6）自动化程度高， 不足之处在于：（ 1）沸点与溶剂相近或低的组分不能测；（ 2）某种意义上失去了 离热不稳定性物质的优点；（ 3）溶剂很难挥发尽，本底效应高，不利于分辨。因此， 处于发展阶段，应用还不够普遍。 6 中药含量测定方面研究状况 于具有其他分析方法无法比拟的分析手段，广泛应用于药物分析中，本文主要介绍其在已知化合物定性分析及结构鉴定、未知成分定性分析以及药物代谢中的应用。 知化合物定性分析及结构鉴定中的应用 张萍等 对细辛类植物中马兜铃酸 A 进行定性及定量分析。采用薄层色谱法鉴别细辛类植物中马兜铃酸 A， 并采用建立的 测定 18 份 细辛属药材、 7种马兜铃属药材中马兜铃酸 A 的含量。用 18(2505m)色谱柱 ,以甲醇 醋酸 (60:36:4)为流动相 ,流速为 柱温 20 ,检测波长 316时采用 对细辛中马兜铃酸 A 结构进行确认。结果细辛中马兜铃酸 r= 谱图中保留时间为 色谱峰 ,经 。 本方法简便、准确 ,灵敏度高 ,可用于细辛类植物中马兜铃酸A 的定性及定量测定。 知成分定性分析中的应用 现代药理学研究表明，柴胡中柴胡皂甙类成分具有解热、镇痛、镇静、镇咳及保肝等作用，而其中含量最高、药理活性最强的是柴胡皂甙 A 和 D。刘密新等用 505m)色谱柱，以乙腈和水为流动相进行梯度洗脱，采用正离子扫描方式、电喷雾法等质谱条件检测到由黄连、柴胡等11 味药材精制而成的中药复方中柴胡皂苷 A 和 D 的 3 个同分异构体。 物代谢中的应用 g志峰等 建立人血浆中苯磺酸氨氯地平高效液相色谱 并研究苯磺酸氨氯地平在健康人体内的药动学行为 ， 评价两片剂的生物等效性 。 方法 是 采用双交叉试验设计 ， 血样用乙醚 2:1)混合液提取 ， 离测定 ， 根据血药浓度 评价生物等效性 。 苯磺酸氨氯地平受试片和参比片的主要药动学参数分别是 ： ( (ng别为 ( (h， 别为 ( (2.1)ngh ， -)分别为 ( (2.3)ngh 。 结论 ： 本法简便 、 灵敏 、 准确 ，统计分析结果表明两片剂具有生物等效性 。 第二章 实验部分 1 仪器与试剂 验仪器 000 超高效液相色谱仪； 质谱仪（ 色谱柱为 谱柱 (100 .1 列超声波清洗机（津奥特塞恩斯仪器有限公司，电压 220V 频率 150电子天平（上海精科天美科学仪器有限公司，工作电压 240V， 频率 50额定功率 12V）；电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司， ，设置为 50 摄氏度）；无油真空泵（产品型号： 验用品 玻璃砂芯过滤装置； 相滤膜（ 有机滤膜（孔径 隆尼龙 66）； 410度管； 10量瓶、 25量瓶；移液枪；烧杯（ 5000 玻璃棒；研钵 剂 原儿茶醛对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，含量以 ，批号： 110810迷迭香酸对照品 （ 中国食品药品检定研究院， 纯度 98%，批号： 丹酚酸 B 对照品 （中国食品药品检定研究院，供含量测定用，含量以 ，批号： 111562复方丹参片（内蒙古仁泽药业有限公司，国药标准字 复方丹参片（广东一力集团制药有限公司，国药标准字 复方丹参滴丸（天士力制药集团股份有限公司，国药准字 丹参注射液（四川升和药业股份有限公司，国药准字 色谱甲醇（纯度 高效液相色谱纯甲酸（科密欧）；保护气氮气（纯度 ；载气氩气（纯度 ；蒸馏水；哇哈哈饮用纯净水（哇哈哈非常可乐饮料有限公司，产品标准号： 7323） 2 方法 器条件的选择 谱条件 色谱柱为 谱柱 (100 .1 流动相为 甲酸水溶液（ A 相）、纯甲醇（ B 相）；流速为 温为 30 ;进样量 10L。梯度洗脱条件如下： 表 1 时间 /速 /mL% B% 0 动相条件的选择 简单介绍我们实验过程中尝试使用过的流动相，以及为何使用目前该流动相。建议将上表放置该处并解释说明。 速的选择 根据所测样品的不同，流速有不同的设置，同一种样品，流速既不能太大也不能太小。 因柱效是柱中流动相线性流速的函数 ,使用不同的流速可得到不同的柱效 要追求最佳柱效 ,最好使用最佳流速。 本实验 流速选择为 谱条件的选择 三重四级杆质谱检测器（ 喷雾离子源（ 描方式：负离子扫描， 电离电压 雾化气：氮气（ 雾化气压力 14雾化挡板电压 V；喷雾针电压 V；检测电压 V；干燥器压力 ，干燥器温度 。碰撞气氩气（ , 碰撞能量 有利于提高母离子碎裂的效率。 子化模式的选择 根据考察电喷雾的检测结果发现，在负离子的模式下检测到响应值较高的准分子离子峰，以及相对峰度较低的离子峰，而在正离子模式下，无特征峰。如图所示，故本论文选择 离子模式 。 量离子对的选择 化合物的母离子与对照品的相同，又有 2 个以上的子离子与对照品的相同且碎裂的比例相差不大，那么基本能确定该化合物与对照品相同，这时的离子就可以说是定性离子。三重四级杆中说到有时候定性和定量同时进行，即为确证方法，能够提供具体的分子量信息。一个药物母离子经过碰撞会得到一些子离子，而其中有比较稳定的，有峰度比较强的，这个时候为了定量的准确性，我们就应该选择最能得到准确和可靠结果的离子作为定量离子，同时他也是定性离子了，同时在选择两个离子对作为辅助定性的离子，因为一个定量离子对还不能达到定性的鉴定点数。 表 2 标准品 准分子（ m/z） 特征离子 1（ m/z）碰撞电压（ V） 特征离子 2（ m/z）碰撞电压（ V） 迷迭香酸 0 0 原儿茶醛 2 5