二硫化钛纳米片材料用于光声成像指导下的肿瘤光热治疗研究.docx

二硫化钛纳米片材料用于光声成像指导下的肿瘤光热治疗研究二硫化钛纳米片材料用于光声成像指导下的肿瘤光热治疗 第一章中文摘要最近，有着不寻常物理化学性质的二维纳米材料在材料科学与工程领域被广泛的研究。石墨烯是一种由碳原子组成呈蜂巢晶格的二维层状材料，显示出特殊的电子，光学，热力学，和机械性能。作为一种石墨烯类似物，过渡族金属二维硫化物如MoS2, MoSe2, WS2, WSe2和Bi2Se3，都是由六边形的金属原子夹在两层硫族元素之间组成三明治结构。近些年这些过渡金属二维硫化物已经发展成为材料科学领域的明星材料，并在包括纳米医药在内的诸多领域有着潜在的应用。二硫化钛是一种典型的过渡族金属二维硫化物材料，其在电子器件领域或作为一种储氢材料在最近被广泛研究。在此篇工作中，我们用自下而上的液相合成方法合成了二硫化钛纳米片，然后用聚乙二醇（PEG）修饰，在各种生理溶液中获得很好的稳定性，以及在体外没有明显的毒性。由于在近红外区有很强的吸收，TiS2-PEG能够被用作光声成像的造影剂。在对携带肿瘤的小鼠进行全身给药后发现材料能够在肿瘤部位实现很高的富集。然后我们将TiS2-PEG纳米片用于体内肿瘤光热治疗，在尾静脉注射纳米材料以及外加近红外激光照射的情况下能够实现肿瘤的完全消融。我们的工作表明，在经过良好的表面修饰后，TiS2纳米片能够作为一种新的光热制剂用于成像指导下的肿瘤治疗。关键词：二硫化钛 光声成像 光热治疗Two-Dimensional TiS2 Nanosheets for in vivo Photoacoustic Imaging and Photothermal Cancer TherapyAbstractRecently, two-dimensional (2D) nanomaterials with unusual physical and chemical properties have been extensively explored in materials science and engineering. Graphene, a 2D single layer of carbon atoms of honeycomb lattice structure, as a typical example, has shown exceptional electronic, optical, thermal, and mechanical properties. As the analogues of graphene, transition-metal dichalcogenides (TMDCs) such as MoS2, MoSe2, WS2, WSe2 and Bi2Se3, consisting of hexagonal layers of metal atoms sandwiched between two layers of chalcogen atoms, have also become a star in materials science in recent years, showing promising applications in many different areas including nanomedicine.Titanium dichalcogenides (TiS2) is a typical class of TMDC materials and has also been studied recently in electronic devices or as a hydrogen-storage material. In this study, TiS2 nanosheets, are synthesized by a bottom-up solution-phase method and then modified with polyethylene glycol (PEG), obtaining TiS2-PEG with high stability in physiological solutions and no appreciable in vitro toxicity. Due to their high absorbance in the near-infrared (NIR) region, TiS2-PEG nanosheets could offer strong contrast in photoacoustic imaging, which uncovers the high tumor uptake and retention of those nanosheets after systemic administration into tumor-bearing mice. We further apply TiS2-PEG nanosheets for in vivo photothermal therapy, which is able to completely eradicate the tumors on mice upon intravenous injection of TiS2-PEG and the followed NIR laser irradiation. Our work indicates that TiS2 nanosheets with appropriate surface coating (e.g. PEGylation) would be promising new class of photothermal agent for imaging-guided cancer therapy.Keywords: TiS2 photoacoustic imaging photothermal therapy 3二硫化钛纳米片材料用于光声成像指导下的肿瘤光热治疗 第二章第二章 TiS2纳米薄片的制备和表面修饰2.1 引言有着不寻常物理化学性质的二维纳米材料在材料科学与工程领域被广泛的研究1。石墨烯是一种由碳原子组成呈蜂巢晶格的二维层状材料，显示出特殊的电子，光学，热力学，和机械性能2。作为一种石墨烯类似物，过渡族金属二硫属化物如MoS2, MoSe2, WS2, WSe2和Bi2Se3，都是由六边形的金属原子夹在两层硫族元素之间组成三明治结构3。近些年这些过渡族金属二硫属化物已经发展成为材料科学领域的明星材料，并在包括纳米医药在内的诸多领域有着潜在的应用4-7。基于过渡族金属二硫属化物的生物传感技术在最近的很多报道中被阐明8。多个课题组包括我们课题组已经探索着使用过渡族金属二硫属化物作为一种新的近红外吸光材料用作肿瘤的光热治疗9。因为过渡金属硫化物的大比表面积，过渡金属硫化物纳米薄片也能作为载药平台用作肿瘤的联合治疗10, 11。TiS2是一种典型的拓扑绝缘体材料，其在电子器件领域或作为一种储氢材料在最近被广泛研究12, 13。传统的二硫化钛薄片是通过化学气相沉积法制备的。这种方式需要在基底上温度超过500度时分解不同的钛和硫前驱体，相对比较复杂而且昂贵。在本篇工作中，我们用自下而上溶液法大规模高质量地合成了TiS2纳米薄片。然后用亲水性的高分子C18PMH-PEG（聚马来酸酐-十八烯聚乙二醇）修饰，合成TiS2-PEG。经过修饰后的TiS2薄片获得良好的水溶性和生理稳定性，以其进行后续的细胞和动物实验。2.2 实验部分2.2.1实验试剂和器材 所有化学试剂通过商业渠道购买，未再经过处理或者纯化。所有实验用水均为去离子水。聚乙二醇（mPEG-NH2，MW=5000）购买自浙江嘉兴博美公司。油胺（OM）、碳十八烯（ODE）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、聚马来酸酐-1-十八烯（C18PMH）从Sigma-Aldrich公司购买。乙醇、四氯化钛（TiCl4）、硫粉、三乙胺（TEA）、二氯甲烷（CH2Cl2）、氯仿（CH3Cl）等从国药集团上海化学试剂公司购买。实验所需耗材购自苏州科益特生物有限公司。2.2.2实验步骤2.2.2.1 TiS2纳米薄片的合成标准的步骤描述如下：1mmol 四氯化钛在室温下加入到20ml 油胺（OM）和10ml 碳十八烯（ODE）混合液的三颈烧瓶中。在氩气保护的环境中，溶液被加热到140 oC并且磁力搅拌约30分钟，去除水分和氧气。然后，溶液的温度被迅速加热到300 oC并在氮气的环境中保持30分钟。将2 mmol 的硫粉末溶于5ml的油胺溶液，然后在300 oC时10分钟内加入到烧瓶中。反应在300 oC保持1小时。然后降低到室温，加入过量的乙醇后，二硫化钛纳米薄片能够被沉淀出来，经过离心收集，并用乙醇反复清洗。2.2.2.2 C18PMH-PEG的合成为了制备C18PMH-PEG，分别称取10mg C18PMH和143mg mPEG-NH2（5K）溶解在5ml 二氯甲烷中，然后向溶液中加入6l 三乙胺，称取11mg EDC加入混合溶液中，血清瓶瓶口用封口膜封好，磁力搅拌反应24h。反应结束后，用氮气将二氯甲烷吹干，加水溶解产物后，将其用移液枪吸入事先准备好的透析袋中，将两端封口的透析袋放入满是双蒸水的大烧杯中进行透析，期间换水5次。透析完后将液体取出进行冻干。得到的产物为白色海绵状。2.2.2.3 TiS2纳米薄片的表面修饰2ml的TiS2储存液（5 mg/ml）经过14800rpm离心5min后去除上清收集沉淀。向沉淀中加入乙醇清洗两遍后，离心收集沉淀溶于氯仿。将20mg的C18PMH-PEG溶于2ml 氯仿后加入到TiS2溶液中。搅拌反应4小时后用氮气吹干氯仿，残余物能够非常容易地溶于水中。离心除去大颗粒从而获得TiS2-PEG。 2.2.2.4 TiS2纳米薄片的表征高分辨透射电子显微镜（HRTEM，加速电压200kV）：美国FEI公司，Tecnai F20。X-射线粉末衍射仪（XRD）：荷兰PANalytical公司，Empyrean，Cu靶。动态光散射仪：英国Malvern公司，ZEN3690。紫外可见近红外分光光度计（UV-vis-NIR）：HORIBA公司，LAMBDA 750。2.3 结果与讨论2.3.1 TiS2纳米薄片的合成与表征TiS2的合成: 在油胺（OM）和十八碳烯（ODE）的混合溶液中加入TiCl4前驱体，整个过程通以氮气并进行加热。在此过程中，钛前驱体溶液逐渐变成深红色，可能是由于TiCl4和OM反应生成了TiCl4-OM复合物。当温度达到300 oC时，溶于OM的硫粉加入到反应溶液中。溶液颜色立刻变成了棕褐色，表明了TiS2快速的形成。对形成的产物用XRD进行分析。图中峰位与资料卡片相一致，并且结果表明合成的TiS2为立方晶相(图2-1a)。TEM图片显示合成的TiS2为二维层状结构，尺寸均一，直径在100nm左右(图2-1b)。高分辨率TEM表明TiS2有着0.254nm 的晶格间隔(图2-1c)。除了C,O,Cu等基底上的元素，只有Ti和S的峰能够在EDS波谱中检测到(图2-1d)。图2-1.(a) TiS2的XRD分析。(b) TiS2的TEM图。(c)TiS2的HRTEM图。(d) TiS2的X射线能量色散光谱。2.3.2 TiS2纳米薄片的表面修饰与表征由于疏水性的油胺包裹在TiS2表面，基于疏水作用，两亲性的高分子如C18PMH-PEG能被用来修饰TiS2，使其获得良好的水溶性。动态光散射数据表明TiS2-PEG最后的尺寸在大概100nm(图2-2a)。经过表面修饰后，TiS2-PEG在包括生理盐水，细胞培养液，牛血清等多种溶液中表现出很好的稳定性(图2-2b inset)。图2-2. (a)PEG修饰的TiS2纳米薄片在水中的动态光散射数据。(b) TiS2纳米薄片的UV-vis-NIR吸收光谱。插图: TiS2-PEG在水、PBS、培养基、牛血清等溶液中的稳定性。2.3.3 TiS2纳米薄片的光热稳定性TiS2纳米薄片的UV-vis-NIR光谱显示出其在紫外到近红外区有着很宽的吸收(图2-2b)。在808nm处TiS2-PEG的消光系数被测定为26.8 Lg-1cm-1，和之前报道的过渡金属二维硫化物如WS2和MoS2等相似。TiS2-PEG在近红外区的强吸收表明它能够作为一种优良的光吸收试剂用于光热治疗。为了检测TiS2-PEG的光热稳定性，我们用0.8W/cm2的808nm激光照射0.1mg/ml的TiS2-PEG溶液，然后测其吸收光谱，光谱未发生明显变化，表明TiS2-PEG纳米薄片在照射近红外激光期间非常稳定(图2-3)。图2-3.经过808nm激光照射不同的时间后，TiS2-PEG的吸收光谱。2.4 本章小结我们成功地用自下而上的方法合成了TiS2纳米薄片，并对其形貌与性质进行了初步表征。实验合成的TiS2纳米薄片呈圆盘状，尺寸均一，直径在100nm左右。经过C18PMH-PEG修饰后，TiS2纳米薄片表现出良好的水溶性，在各种生理溶液中亦有很高的稳定性。从UV-vis-NIR光谱可以看出，TiS2-PEG在近红外区有很强的光吸收。TiS2-PEG经过808nm激光长时间照射后，吸收光谱仍然不变，表现出良好的光热稳定性，具有应用于光热治疗的潜力。参考文献1. Butler, S. Z.; Hollen, S. M.; Cao, L.; Cui, Y.; Gupta, J. A.; Gutierrez, H. R.; Heinz, T. F.; Hong, S. S.; Huang, J.; Ismach, A. F., Progress, challenges, and opportunities in two-dimensional materials beyond graphene. ACS nano 2013, 7, 2898-2926.2. Geim, A. K.; Novoselov, K. S., The rise of graphene. Nature materials 2007, 6, 183-191.3. Wilson, J.; Yoffe, A., The transition metal dichalcogenides discussion and interpretation of the observed optical, electrical and structural properties. Advances in Physics 1969, 18, 193-335.4. Wang, Q. H.; Kalantar-Zadeh, K.; Kis, A.; Coleman, J. N.; Strano, M. S., Electronics and optoelectronics of two-dimensional transition metal dichalcogenides. Nature nanotechnology 2012, 7, 699-712.5. Dines, M. B., Lithium intercalation via n-butyllithium of the layered transition metal dichalcogenides. Materials Research Bulletin 1975, 10, 287-291.6. Tributsch, H., LayerType Transition Metal Dichalcogenidesa New Class of Electrodes for Electrochemical Solar Cells. Berichte der Bunsengesellschaft fr physikalische Chemie 1977, 81, 361-369.7. Bringley, J. F.; Liebert, N. B., Controlled chemical and drug delivery via the internal and external surfaces of layered compounds. Journal of dispersion science and technology 2003, 24, 589-605.8. Pumera, M.; Loo, A. 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Journal of the American Chemical Society 2003, 125, 5284-5285.27二硫化钛纳米片材料用于光声成像指导下的肿瘤光热治疗 第三章第三章 TiS2-PEG在细胞内的光热治疗3.1 引言光热治疗作为一种新的肿瘤治疗模式在近些年引起了广泛的关注1。通过使用近红外的吸光试剂将光能转化为热能从而烧毁肿瘤，光热治疗相比传统的肿瘤治疗方式如手术、化疗、放疗等有着明显的优势，其能够对肿瘤进行定点杀伤而不影响正常组织，实现了高效率和最小的侵袭性。由于肿瘤的EPR效应或在光热试剂表面偶联上靶向分子，光热试剂经注射进入体内后能够被动或主动地富集于肿瘤部位，在外加激光的情况下，能够杀伤肿瘤细胞。最近，很多近红外有吸收的纳米材料被发展成为光热试剂用作肿瘤治疗，如金纳米材料2, 3，碳基纳米材料4-6，硫化铜纳米颗粒7, 8，钯纳米片9, 10，以及一些有机高分子聚合物11, 12和自组装有机小分子13。我们用PEG对合成好的TiS2纳米薄片进行表面修饰，使其在各种生理溶液中获得良好的稳定性，提高了生物相容性，对肿瘤细胞亦没有明显的毒性。对TiS2-PEG的表征发现其在近红外光区有着很强的吸收，在这章中我们考察了TiS2-PEG在体外对4T1肿瘤细胞的光热杀伤效果。3.2 实验部分3.2.1 实验试剂和器材所有化学试剂通过商业渠道购买，未再经过处理或者纯化。所有实验用水均为去离子水。聚乙二醇（mPEG-NH2，MW=5000）购买自浙江嘉兴博美公司。油胺（OM）、碳十八烯（ODE）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、聚马来酸酐-1-十八烯（C18PMH）从Sigma-Aldrich公司购买。乙醇、四氯化钛（TiCl4）、硫粉、三乙胺（TEA）、二氯甲烷（CH2Cl2）、氯仿（CH3Cl）等从国药集团上海化学试剂公司购买。实验所需耗材购自苏州科益特生物有限公司。4T1（小鼠乳腺癌细胞）从美国细胞库（American Type Culture Collection，ATCC）购买。细胞培养液等相关试剂从Invitrogen公司购买。3.2.2 实验步骤3.2.2.1 细胞毒性实验小鼠的乳腺癌细胞（4T1）从美国细胞库（ATCC）获得。从液氮中取出细胞冻存管迅速解冻后离心去除上清，将细胞用RPMI-1640培养基重悬后加入培养皿中，培养于37，5% CO2浓度的培养箱中。待培养一段时间后细胞铺满培养皿底部，用胰蛋白酶将细胞消化后加入到96孔板中，每孔约含细胞2105个，培养过夜后，加入经过离心除菌处理的0.0015-0.1mg/ml的不同浓度TiS2-PEG并孵育24小时。通过MTT方法测得细胞的相对活力。3.2.2.2 光热升温实验将去离子水和0.06、0.12、0.25、0.5mg/ml的TiS2-PEG各取2ml加入宽度为1cm的比色皿中，用三脚架固定好红外热成像仪，调节808nm激光器使其功率密度为0.8W/cm2，用激光器照射比色皿的同时用红外热成像仪进行成像和温度记录。记录各组样品5分钟内的升温过程。每隔30s取一次温度值，绘制出不同浓度TiS2-PEG溶液以及超纯水5分钟内的升温曲线。3.2.2.3 光热杀伤实验小鼠的乳腺癌细胞（4T1）从美国细胞库（ATCC）获得。从液氮中取出细胞冻存管迅速解冻后离心去除上清，将细胞用RPMI-1640培养基重悬后加入培养皿中，培养于37，5% CO2浓度的培养箱中。待培养一段时间后细胞铺满培养皿底部，用胰蛋白酶将细胞消化后加入到96孔板中，每孔约含细胞2105个，培养过夜后，与0.0125、0.025、0.05、0.1mg/ml的TiS2-PEG孵育6h，然后用0.8W/cm2的808nm激光照射5min。通过MTT测得细胞相对活力。3.2.2.4 光热成像实验4T1细胞用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基培养于37，5% CO2浓度的培养箱中。待细胞生长状态良好并基本铺满培养皿底部后，用胰蛋白酶消化后，取适量细胞悬液加入4个35mm的培养皿中继续培养。待细胞生长铺满培养皿底部后，加入不同浓度的TiS2-PEG并孵育4小时，对照组加入同体积的PBS。然后用0.8W/cm2的808nm激光照射5分钟。照射完后用PBS清洗两遍，并用台盼蓝染色30分钟，再经PBS洗过后用Leica光学显微镜进行成像。3.2.3 仪器表征高分辨透射电子显微镜（HRTEM，加速电压200kV）：美国FEI公司，Tecnai F20。X-射线粉末衍射仪（XRD）：荷兰PANalytical公司，Empyrean，Cu靶。动态光散射仪：英国Malvern公司，ZEN3690。紫外可见近红外分光光度计（UV-vis-NIR）：HORIBA公司，LAMBDA 750。激光器：北京海特光电科技有限公司。红外热成像仪：Irsight Systems公司。3.3 实验结果与讨论3.3.1 TiS2-PEG的细胞毒性在使用PEG修饰的TiS2纳米薄片用于体内的成像和治疗前，我们先用MTT实验检测了它的细胞毒性。不同浓度的TiS2-PEG与细胞孵育24h后，可以观察到即使TiS2-PEG的浓度高至0.1mg/ml，对于4T1细胞也没能观察到明显的毒性，表明该纳米材料有着低细胞毒性和良好的生物相容性(图3-1)。该材料显示出的良好生物安全性为接下来的应用奠定了基础。图3-1. 细胞毒性试验。4T1细胞与不同浓度的TiS2-PEG孵育24h后的细胞相对存活率。细胞相对存活率由标准的MTT方法测得。3.3.2 TiS2-PEG的光热治疗3.3.2.1 升温曲线的测定TiS2-PEG的光热升温曲线如图所示，水和不同浓度的TiS2-PEG用0.8W/cm2的808nm激光照射，用红外热成像仪记录其5分钟内升温过程(图3-2b)。实验发现，去离子水的升温不明显，而随着TiS2-PEG浓度的增加，升温的幅度也变大(图3-2a)。这是因为TiS2-PEG在近红外光区有很强的吸收，能够将光能转化为热能，从而导致溶液温度的升高。图3-2. TiS2-PEG 的升温实验。(a) 水和不同浓度的TiS2-PEG在0.8W/cm2的808nm激光照射后的光热升温曲线。(b) 水和不同浓度的TiS2-PEG在0.8W/cm2的808nm激光照射后的热成像图。3.3.2.2 TiS2-PEG对肿瘤细胞的光热杀伤然后我们使用TiS2-PEG作为光热材料在激光照射的情况下用于体外的肿瘤细胞杀伤。4T1细胞和不同浓度的TiS2-PEG孵育6小时，然后加以0.8W/cm2的808nm激光照射。MTT实验结果表明，随着TiS2-PEG浓度的增加，更多的肿瘤细胞被杀死(图3-3a)。在与0.1mg/ml TiS2-PEG孵育并以0.8W/cm2激光照射5分钟后视野中几乎全是死细胞，表明大部分肿瘤细胞在激光照射期间都被杀死了(图3-3b)，此结果与MTT实验中的数据亦相吻合。该实验表明TiS2-PEG能够作为一种非常有效的光热试剂。图3-3. (a)细胞和不同浓度的TiS2-PEG孵育6h后，以0.8W/cm2激光照射5分钟后的细胞相对存活率。(b)经过不同浓度的TiS2-PEG孵育和激光照射，用台盼蓝对细胞进行染色并拍下光学照片。3.4 本章小结在本章中，我们探究了TiS2-PEG对4T1肿瘤细胞的毒性，经过PEG修饰的TiS2即使在浓度较高时亦未见明显的细胞活性影响，表明该材料有着良好的生物相容性。光热升温的实验发现随着材料浓度的增大，升温的效果也越明显。表明该材料可以作为潜在的光热试剂用作光热治疗。将4T1细胞与不同浓度的TiS2-PEG孵育后，外加808nm激光照射，显示出明显的肿瘤细胞杀伤效果，并呈现浓度依赖性关系。体外细胞实验获得了良好的肿瘤光热治疗效果，为进行进一步体内肿瘤光热治疗奠定了基础。参考文献1. Huang, X.; El-Sayed, I. H.; Qian, W.; El-Sayed, M. A., Cancer cell imaging and photothermal therapy in the near-infrared region by using gold nanorods. Journal of the American Chemical Society 2006, 128, 2115-2120.2. El-Sayed, I. 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Journal of the American Chemical Society 2010, 132, 1929-1938.二硫化钛纳米片材料用于光声成像指导下的肿瘤光热治疗 第四章第四章 TiS2-PEG在活体上的光声成像和光热治疗4.1 引言光声技术具有比近红外技术更好的生物组织穿透性，同时具有无副作用、分辨率高等特点1。光声成像系统能够实现内源性的结构成像，在光声试剂的辅助下更能够得到对比度更高的图像。目前它已经被用于生物医学研究的各个领域2-6。细胞水平的实验已经证明TiS2-PEG可以作为很好的光热试剂用作肿瘤细胞的治疗。在这章中，我们利用材料本身具有的光学性质，通过尾静脉将材料注射到小鼠体内，利用光声断层扫描仪对肿瘤部位进行光声成像。由于TiS2-PEG在肿瘤部位有很高的富集，所以肿瘤的光声成像效果非常明显。目前，很多纳米材料如金纳米材料7, 8，碳纳米管9, 10，石墨烯11-13等都已经实现了活体的肿瘤治疗。我们在光声成像的指导下，尝试着将TiS2-PEG用于活体水平的肿瘤光热治疗。通过尾静脉注射TiS2-PEG进带有4T1肿瘤的小鼠体内，外加808nm激光照射，记录肿瘤的生长情况以及小鼠的生存率，观察TiS2-PEG在活体水平的肿瘤光热治疗效果。结果表明，经过光热治疗的肿瘤能够全部被杀灭，显示出TiS2-PEG作为光热试剂的良好性能。4.2 实验部分4.2.1 实验试剂与器材所有化学试剂通过商业渠道购买，未再经过处理或者纯化。所有实验用水均为去离子水。聚乙二醇（mPEG-NH2，MW=5000）购买自浙江嘉兴博美公司。油胺（OM）、碳十八烯（ODE）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、聚马来酸酐-1-十八烯（C18PMH）从Sigma-Aldrich公司购买。乙醇、四氯化钛（TiCl4）、硫粉、三乙胺（TEA）、二氯甲烷（CH2Cl2）、氯仿（CH3Cl）等从国药集团上海化学试剂公司购买。实验所需耗材购自苏州科益特生物有限公司。4T1（小鼠乳腺癌细胞）从美国细胞库（American Type Culture Collection，ATCC）购买。细胞培养液等相关试剂从Invitrogen公司购买。实验用雌性BALB/c小鼠购买自南京彭升生物科技有限公司，所有小鼠都在苏州大学动物中心批准的协议下使用。4.2.2 实验步骤4.2.2.1 肿瘤模型建立4T1细胞用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RMPI-1640培养基培养。待细胞可用作肿瘤接种时，将培养基吸去，加入胰酶消化，离心后用PBS清洗，最后将细胞重悬于约30l的无血清培养基中。将该30l悬浮有106个4T1细胞的无血清RMPI-1640培养基皮下注射到每只小鼠的背部。肿瘤生长一周，其体积大概为60mm3时，可进行后续实验。4.2.2.2 体内光声成像用光声计算机断层扫描仪进行光声图像采集。实验中用戊巴比妥钠（50mg/kg）对小鼠进行麻醉。通过使用水热系统使小鼠体温维持在37.5 oC。在成像前，将TiS2-PEG尾静脉注射进带有肿瘤的小鼠体内。4.2.2.3 体内光热治疗在尾静脉注射TiS2-PEG（2mg/ml, 200l, dose=20mg/kg）进荷瘤小鼠12小时后，用808nm的近红外激光以0.8 W/cm2的功率照射5分钟。对照组小鼠分别注射相同体积的生理盐水并加以激光照射和注射TiS2-PEG但不加激光照射。肿瘤表面的温度用热成像仪记录。肿瘤的体积用游标卡尺每隔一天进行测量。肿瘤体积=肿瘤长度肿瘤宽度2/2。相对肿瘤体积以V/V0表示（V0是治疗开始前的肿瘤体积）。4.2.2.4 组织切片分析尾静脉注射TiS2-PEG 30天后，分别取治疗组和对照组3只小鼠进行CO2窒息后解剖，收集主要的组织器官，进行固定，石蜡包埋后切成8微米左右的薄片，并用苏木素/伊红（H&E）染色。用光学显微镜对各器官进行拍照。4.2.3 仪器表征高分辨透射电子显微镜（HRTEM，加速电压200kV）：美国FEI公司，Tecnai F20。X-射线粉末衍射仪（XRD）：荷兰PANalytical公司，Empyrean，Cu靶。动态光散射仪：英国Malvern公司，ZEN3690。紫外可见近红外分光光度计（UV-vis-NIR）：HORIBA公司，LAMBDA 750。激光器：北京海特光电科技有限公司。红外热成像仪：Irsight Systems公司。光声断层扫描仪：Endra公司 Nexus128, Ann Arbor, MI。4.3 实验结果与讨论4.3.1 TiS2-PEG用于活体水平的光声成像光声成像是一种非创伤性的成像模式，与传统的光学成像模式相比，它能够提供更高的体内空间和深度分辨率(图4-1b)。我们发现有着近红外强吸收的TiS2-PEG能够被用作良好的光声成像造影剂(图4-1a)。带有4T1肿瘤的雌性Balb/c小鼠通过尾静脉注射TiS2-PEG。然后在0,2,4,8,12,24小时等时间点采集肿瘤的光声成像图片(图4-1c)。在注射TiS2-PEG之前，只能看到肿瘤内主要的血管。注射TiS2-PEG后能够观察到很强的光声信号并分散在整个肿瘤中，说明了纳米薄片在肿瘤内有效的富集。这一现象可能是由于肿瘤的高通透性和滞留效应。图4-1. 肿瘤光声成像。(a)水和TiS2-PEG的光声图片。(b)尾静脉注射TiS2-PEG后的光声成像示意图。(c)尾静脉注射TiS2-PEG后，不同时间点的肿瘤光声成像图。4.3.2 TiS2-PEG用于小鼠肿瘤的光热治疗然后，我们使用TiS2-PEG作为光热试剂用作体内肿瘤治疗。带有4T1肿瘤的小鼠分别尾静脉注射TiS2-PEG溶液（2mg/ml，200l）和生理盐水。注射完24小时后，将小鼠身上的肿瘤用0.8W/cm2功率的808nm激光照射5分钟。用红外热成像仪记录这些肿瘤的温度变化。由于TiS2-PEG的强近红外吸收以及高肿瘤富集，注射TiS2-PEG的小鼠的肿瘤温度在激光照射下5分钟内升高到65左右。注射生理盐水的对照组在相同条件下肿瘤的表面温度只有一点变化(图4-2a)。我们同时对TiS2-PEG的体内肿瘤光热治疗效果进行评估。当肿瘤体积达到60mm3后，接种有4T1肿瘤的小鼠被分成4组，每组5只。治疗组小鼠通过尾静脉注射TiS2-PEG。24小时后将小鼠用0.8W/cm2的808nm激光照射5分钟。其他三个对照组分别为注射PBS照激光组，注射PBS不照激光组以及注射TiS2-PEG不照激光组。实验发现治疗组小鼠的肿瘤在1天后小时，原始肿瘤位置留下黑色的疤痕，并于十天后脱落(图4-2d)。每2天测量各组小鼠肿瘤的体积。治疗组小鼠的肿瘤完全消融，而其他组的肿瘤都生长得很快(图4-2b)。三个对照组的小鼠都在16天内死亡，而经过光热治疗的实验组小鼠都存活超过60天(图4-2c)。我们的实验结果表明TiS2-PEG是一种非常高效的光热试剂，能够被用作体内的肿瘤治疗。图4-2. 体内光热治疗。(a)经过尾静脉注射TiS2-PEG溶液(2 mg/mL, 200 l)和0.8W/cm2的808nm激光照射5分钟的荷瘤小鼠红外热成像图。(b)经过不同治疗后各组小鼠肿瘤的生长曲线。相对肿瘤体积与原始体积进行归一化。治疗组小鼠在尾静脉注射TiS2-PEG后照射0.8W/cm2的808nm激光5分钟。另外三组用作对照组：注射生理盐水组；注射TiS2-PEG但不照激光组；照激光但不注射TiS2-PEG组。(c)经过各种处理后各组小鼠的生存曲线。(d) 尾静脉注射TiS2-PEG后，照射激光前和照射激光10天后小鼠的照片。4.3.3 TiS2-PEG对小鼠的毒性研究我们探究了TiS2-PEG纳米薄片的体内潜在毒性