《动物细胞工程学》实验课教学大纲.doc

动物细胞工程学实验课程教学大纲实验名称：动物细胞工程学实验课程编码：0141014学时：32学分：2适用专业：生物工程执笔人：唐业刚审订人：郭云贵一、 课程的性质与任务动物细胞培养技术是动物胚胎工程技术的基础和核心技术，开设该门实验课的最大任务和任务就是让学生掌握动物细胞培养技术的原理和基本方法，锻炼学生的专业素养。应此，在教学过程中应着重培养和锻炼学生自己寻找感兴趣的小课题并能运用理论和实验操作知识独立进行实验设计、实验可行性等这种提出问题、分析问题和解决问题的能力。二、教学目标与基本要求：了解动物细胞培养实验室的设计和基本设备。理解动物细胞培养的实验原理和常用基本仪器设备的作用。掌握常见大型仪器的使用方法和原代细胞培养、传代培养的流程和方法。三、实验项目与类型：序号实验项目学时实验性质备注演示验证设计综合必做选做1动物细胞一般培养过程教学录像观摩4 2实验室组成设计及实验容器具的洗涤、包扎和灭菌43常用细胞培养用液的配制4 4鸡胚成纤维细胞的原代培养（消化法） 4 5鸡胚成纤维细胞的传代培养46鼠肺成纤维细胞的原代培养（组织块法） 4 7MTT法绘制细胞生长曲线 48小鼠胚胎干细胞的分离与培养 4四、实验教学内容及学时分配：实验一、动物细胞一般培养过程教学录像观摩（4学时）1.目的要求：了解动物细胞培养实验室组成、仪器及细胞培养的一般过程。2.方法原理：通过观看教学录像，以及参观实验室，加深对动物细胞培养条件的理解；通过学习教学录像内容，认识到无菌操作技术在整个细胞培养实验中的重要作用。3.掌握要点：熟悉动物细胞培养的总体流程；掌握实验所需的关键仪器设备的使用方法；认识到动物细胞培养比其他实验要求更高、更严。4.实验内容：讲述动物细胞培养的发展历史。观看录像，利用PPT多媒体教学手段观看细胞培养教学录像。参观实验室的仪器设备及实验室设计，讲解仪器使用方法及实验室设计思路。简要介绍该课程整体实验项目，课程考核方式及成绩评定办法等事宜说明。实验二、实验室组成设计及实验容器具的洗涤、包扎和灭菌（4学时）1.目的要求： 掌握清洁液的配置方法；掌握动物细胞培养所用器皿的种类、作用及清洗灭菌方法；掌握滤器的使用方法2.方法原理：体外培养的动物细胞对微量有害物质十分敏感，了获得较好培养效果，对培养容器具的无害化处理是十分重要的。3.主要实验仪器及材料：电热鼓风干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、三重玻璃蒸馏器、澡盆、脸盆等；橡胶手套、一次性塑料手套、医用纱布、牛皮纸、硫酸纸，棉线等。4.掌握要点：清洁液的配制方法；玻璃器皿、塑料制品和金属制品的洗涤、包扎及灭菌的程序和方法；滤器的使用方法5.实验内容：清洁液的配置；玻璃器皿和塑料制品的清洗、包扎和灭菌；滤器的使用实验三、常用细胞培养用液的配制（4学时）1.目的要求：掌握几种常见细胞培养用液的配制和灭菌方法；了解每种细胞培养用液的作用。2.方法原理：细胞培养用液是直接与细胞接触的，它的配制是细胞培养前的重要环节。3.主要实验仪器及材料：三重玻璃蒸馏器、高压蒸汽灭菌锅、电热干燥箱、无菌操作台、0.22um一次性微孔滤器及滤膜、磁力搅拌器、电子天平、烧杯、容量瓶、量筒、玻棒等。4.掌握要点：滤膜的检测及过滤除菌方法；胎牛血清的解冻、灭活及使用方法；各种细胞培养用液的配置方法5.实验内容：D-hanks液的配制；D-PBS的配制；胰蛋白酶溶液的配制；RPMI1640、DMEM培养基的配制实验四、鸡胚成纤维细胞的原代培养（消化法）（4学时）1.目的要求：掌握动物细胞原代培养的一般方法和原理；能利用课堂所学对自己感兴趣的小项目自己动手设计方案并具体实施。2.方法原理：细胞存在于组织中，生理状况下细胞细胞之间联系紧密，胰酶消化液和EDTA液可以离散这些紧密联系的细胞，使细胞从组织中脱离出来，收集后培养就可以得到大量细胞。3.主要实验仪器及材料：医用手术器械、托盘、超净台、倒置显微镜、温箱、低速离心机、吸管、细胞培养瓶、烧杯、离心管、150目不锈钢网筛等、9日龄鸡胚、 0.25胰酶液、D-hanks液、DMEM培养基、小牛血清。4.掌握要点：细胞原代贴壁培养的一般方法和原理；原代培养过程中的无菌操作。5.实验内容：取材、洗涤、剪切、消化、终止消化、过滤、收集滤液离心、制细胞悬液、计数及活性检查、接种和观察。实验五、鸡胚成纤维细胞的传代培养（4学时）1.目的要求：掌握动物细胞传代培养的一般方法和原理；能利用课堂所学独立完成相关实验。2.方法原理：利用胰蛋白酶将细胞从瓶壁上游离出来，然后稀释分瓶培养。3.主要实验仪器及材料：超净台、倒置显微镜、温箱、低速离心机、吸管、细胞培养瓶、烧杯、离心管等单层鸡胚成纤维细胞、0.25胰酶液、D-hanks液、DMEM培养基、小牛血清。4.掌握要点：细胞传代培养的一般方法和原理；传代培养过程中的无菌操作。5.实验内容：倒掉原培养液、消化、终止消化、分瓶培养。实验六、小鼠肺组织块培养（4学时）1.目的要求：掌握动物细胞组织培养的原理和方法。2.方法原理：组织是由细胞构成，因此通过体外培养组织，使组织中的细胞游离出来，再对其进行培养也是动物细胞体外获得的方法之一。3.主要实验仪器及材料： 超净台、倒置显微镜、CO2培养箱、剪刀、眼科镊子、弯头镊子、培养瓶、培养皿、青霉素瓶、烧杯、酒精、PBS、含10胎牛血清的RPMI1640、双抗4.掌握要点： 组织培养过程中的无菌操作。5.实验内容：处死动物、取材、洗涤、剪切、再洗涤、接种、翻转干涸、翻正培养瓶静止培养和观察实验七、MTT法绘制细胞生长曲线（4学时）1.目的要求：理解和掌握MTT法检测细胞活力的原理和方法2.方法原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶甲臜颗粒，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)/SDS-HCl能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶标仪检测，在以570nm波长处测定其光吸收值（OD值），可间接反映活细胞数量和细胞生长活力。3.主要实验仪器及材料：倒置显微镜、CO2细胞培养箱、酶联免疫检测仪、低速离心机、细胞培养瓶、15ml离心管、血球计数板、盖玻片、计数器、移液器、枪头、酒精棉球、96孔培养板等、RPMI1640/DMEM、小牛血清、0.25%胰蛋白酶、台盼蓝、MTT 工作液、DMSO等4.掌握要点： 细胞培养技术及酶联免疫检测仪的使用方法。5.实验内容： 将细胞培养于96孔培养板，分别于不同时间加MTT反应，加DMSO显色酶标仪测吸光值，以培养时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制生长曲线。 实验八、小鼠胚胎干细胞的分离与培养（4学时）1.目的要求： 掌握小鼠胚胎干细胞的分离方法及培养方法；了解小鼠胚胎干细胞的鉴定方法2.方法原理： 胚胎干细胞出现在胚胎发育的囊胚内层，通过胰酶消化法可从中分离出胚胎干细胞，并进行培养以及鉴定。3.主要实验仪器及材料： 细胞培养用品和设备、玻璃吸管、显微外科手术器械、倒置显微镜、解剖显微镜、离心机、8-10周龄小白鼠、胎牛血清、非必需氨基酸、二巯基丙醇、丙酮酸钠、bEGF、Percoll细胞分离液、丝裂霉素C、胰蛋白酶4.掌握要点： 掌握小鼠胚胎干细胞的分离与培养方法5.实验内容：获取胚鼠成纤维细胞；MEF滋养层的制备；获取胚胎生殖细胞；胚胎生殖细胞的常规培养；胚胎生殖细胞的鉴定 五、考核办法：平时成绩70（到课情况、课堂表现、实验报告完成情况）期末考查 30（理论考查，书面或口头提问与回答的方式）六、实验教学指导书和参考书： 实验指导书：动物细胞培养技术（内部自编教材）。参考