第17章 双RNA病毒科(Birnaviridae).doc

第十七章 双RNA病毒科（Birnaviridae）一、概述二、水生双RNA病毒属 传染性胰坏死病毒三、禽双RNA病毒属 传染性法氏囊病病毒主要参考文献一、 概 述本科病毒形态与呼肠孤病毒相似，过去归于呼肠孤病毒科，亦曾作为分类地位未定的病毒。1973年，当人们认识到该科成员中的传染性胰坏死病毒和传染性法氏囊病病毒在形态学上很相似，尤其是它们的基因组都含有双股双节段RNA后，建议设立一个新科。1984年正式命名为双RNA病毒科。在国际病毒分类委员会（ICTV）第4次报告中，作为可能的双RNA病毒科。在1991年ICTV第5次报告中，正式独立为一个新的科，仅设一个属CD2双RNA病毒属。在199年ICTV第6次报告中，将双RNA病毒科分设三属，即水生双RNA病毒属（代表种为传染性胰坏死病毒）、禽双RNA病毒属（代表种为传染性法氏囊病病毒）以及昆虫双RNA病毒属（代表种为果蝇的病毒）。该科的其它成员还有双瓣软体动物的Tellina病毒（TV）和牡蛎病毒（Oyster virus，OV）。本科病毒呈二十面体对称，球形，粒子直径大小约60nm，核衣壳有32个壳粒，92个形态亚单位。无囊膜，表面无突起。无特征性双层衣壳而区别于呼肠孤病毒。采用EDTA、胰酶或胰凝乳蛋白酶处理纯化的病毒，易于丢失核心。病毒氯化铯浮密度为133g/cm3，对乙醚、氯仿稳定，对酸、碱（pH39）及热（56，30分钟）相对稳定，在20 pH75的环境中，能抵抗1%SDS达30分钟而活力不丧失。病毒分子量为55106Da，S20w=435。病毒粒子有4种结构多肽和一种依赖RNA的RNA聚合酶，不含类脂。病毒基因组占整个病毒粒子重量的97%，为线性双股、双节段RNA，无感染性，大小分别为A节段33kb，B节段38kb。病毒在胞浆内复制，成熟的病毒粒子集积在胞浆中，细胞裂解时释放出大约半数的子代病毒，另一半仍与细胞结合。本科病毒能水平传播，还可能垂直传播，尚未发现任何生物传播媒介。双RNA病毒与呼肠孤病毒的特性比较见表17-1。表17-1 双RNA病毒科与呼肠孤病毒科的特性比较 RNA RNA 总 结构 病毒粒 病毒粒 宿主 核酸型 节段 分子量 多肽 浮密度 子大小 子衣壳 范围双RNA病毒双股RNA 2 4 8103 kb 4 1.33gcm 3.60nm 单层 禽, 鱼, 甲 壳动物, 昆虫, 软体动物 呼肠孤病毒双股RNA10121210320103kb610133139gcm36080nm双层哺乳动物, 禽, 鱼, 昆虫, 植物二、水生双RNA病毒属（Aquabirnavirus）同义名：双RNA病毒属（%Birnavirus%）传染性胰坏死病毒（Infectious pancreasic necrosis virus）同义名：鳟鱼传染性胰腺坏死病毒（Infectious pancreas necrosis virus of trout）传染性胰坏死病是鲑科鱼的一种高度接触传染性的急性病毒性疾病，主要发生于人工养殖的虹鳟鱼场，20周龄以内（一指长，开食后不久）的虹鳟鱼苗最为易感。病鱼典型症状为游动异常，沿身体纵轴剧烈转圈，此后可能因衰竭而卧底不起，不久死亡。病鱼体色深暗，腹部膨胀，眼球突出，皮下出血，死亡率在10%90%之间。剖检见胃及前肠中有粘稠的牛奶样内容物，并常见有出血斑。病理组织学变化主要是胰腺组织坏死，有时波及附近的脂肪组织，在变性的胰腺腺泡组织内，可见圆形或卵圆形的胞浆内包涵体。本病最早于1941年在北美发现，1960年证实其病原为传染性胰坏死病毒（IPNV）。此后传至欧洲。目前除澳大利亚和新西兰外，其它各产鱼国均有发现，是最重要的鱼病之一，许多国家列为均将本病鱼类进口的重点检疫项目。我国山西从日本进口的虹鳟鱼中也发生了此病，在台湾省从日本鳗及泥鳅分离到的适应于30水温的毒株，对非鲑科鱼有致病性，令人关注。1. 形态 病毒粒子为无囊膜的廿面体，直径约60nm。在感染细胞的超薄切片中，核心的直径为45nm。2. 理化特性具有4种结构多肽Vp1、Vp2、Vp3、Vp4，分子量分别为94kDa、54kDa、31kDa和29kDa。Vp1是一种次要蛋白，既能以游离蛋白形式又能以结合蛋白形式存在；Vp2是衣壳蛋白的主要成分，为糖蛋白；Vp4是Vp3的裂解产物，而传染性法氏囊病病毒和果蝇X病毒的Vp4是独特存在的多肽。基因组每个节段RNA都与Vp1相结合，因此每个病毒都有4个分子量为94kDa的结合蛋白。基因节段A为3 092bp，内含一个大的开放阅读框架（ORF），编码一个104kDa的多聚蛋白（polyprotein），其排列顺序为5前Vp2(62kDa)NS(27kDa)Vp33，以后再共转译成二个片段，即前Vp2和NSVp3。在病毒成熟过程中，前Vp2再进一步裂解成Vp2。现已证实，NS多肽的羧基端含有病毒蛋白酶的活性位点。基因节段B为2 784bp，编码Vp1和一假定的RNA聚合酶。病毒对环境因素的抵抗力极强，是已知鱼类病毒中最稳定的。在水中存活时间可超过230天，在粘液中超过210天，在50%甘油中4存活2年半。在4水中毒力至少可维持 56个月，在4干燥环境中残余毒力可维持4周以上。在10的自来水中可存活7个月以上，60加温一小时不能使其完全灭活。未经处理的海水17天后即不再能检出病毒，但上述的水如经过滤或高压处理，病毒存活的时间将延长4倍。臭氧在软水中30秒钟可灭活病毒，在硬水中则需10分钟。30%福尔马林、2%烧碱、有机碘、紫外线及射线可迅速灭活病毒。3. 抗原性根据抗原性的差异，过去将传染性胰坏死病毒分为3个亚型，即IPNVSp、IPNVAb及IPNVVR299，前二株作为欧洲毒株的代表，后一株作为美洲株的代表。1985年Hill将所报道的毒株重新分类，按其血清学关系分为两组，1组有9个血清亚型，2组有1个亚型，见表17-2，Chrisfie等（1988）报道1组的另一新亚型IPNVN1。已在实验室内证实IPNV血清型间的基因片段重组。毒株间的毒力亦有较大的差异，在自然条件下IPNVSp株的毒力较强，经细胞培养传代可致弱，最终变为无毒株。表17-2 IPNV的血清学分型血清型代表宿主流行区域1组IPNVSpIPNVAbIPNVHeIPNVTeIPNVWBIPNVJaIPNVC1IPNVC2IPNVC3IPNVN12组IPNVTV虹鳟虹鳟狗鱼樱蛤虹鳟美洲红点鲑,虹鳟鲑虹鳟欧鳟鲑樱蛤、鲤欧洲、北美欧洲、亚洲欧洲欧洲北美、亚洲加拿大加拿大加拿大加拿大欧洲欧洲IPNV的Vp2与中和抗体产生有关，针对Vp3的单克隆抗体不能中和病毒粒子的感染性。IPNV中的一些分离株（如IPNVSp、IPNVAb及IPNVWB）在pH60的条件下能凝集某些品系小鼠（BALB/C）的红细胞。4. 培养病毒易于适应新鳍类鱼的传代细胞培养物，最常用的易感细胞为CHSE214及RTG2细胞系，均可产生细胞病变。在RTG2还可形成清晰易辨的蚀斑，特征为死亡细胞皱缩拉长成网状。较新的细胞系AS及PG也很常用，FHM或BF2虽也可用，但有时不产生细胞病变。培养温度430，一般用20，复制周期为1620小时，通常在48小时培养后出现以细胞崩解为特点的细胞病变。如用26培养，病毒增殖加快，在9小时内即可出现细胞病变。IPNVSp株在RTG2传代的过程中毒力减弱，蚀斑从05mm增大至2mm，后者成为无毒株。来源于两栖类、鸟类或哺乳动物的细胞不能支持IPNV增殖。5. 病原性病毒主要危害鲑科鱼，20周龄的虹鳟鱼最为易感。成年鲑科鱼感染后常无症状，成为带毒者，此种鱼在疫区占有相当比例，终身排毒。主要经粪、精液或卵，尿也有可能。粪的含毒量很大，污染池水中的病毒高达每升105 TCID50。非鲑科鱼及贝类可能作为病毒贮主，但从它们体内所分离到的毒株对虹鳟多不致病。水温对鱼病来说至关重要，已证实感染IPNV的虹鳟鱼苗在6下死亡率要大大低于在10的死亡率，而在16时则完全没有损失。河鳟也有类似的情况，在10时感染IPNV的死亡率为74%，15时为46%，而在45时所有鱼都能耐过，这是因为15是鱼体免疫防卫的最佳温度，而在45则抑制了病毒的复制。病毒经水平和垂直途径传播，潜伏期短，典型者只需35天，最初入侵的门户为消化道或鳃。病毒对胰腺、性腺及肾组织有亲嗜性。近年来研究发现这种病毒有非常广泛的感染谱。据统计，目前已发现本病毒感染的动物至少有1种环口动物、37种硬骨鱼、6种贝类、2种蜗牛及3种虾。不仅能感染淡水鱼，也能感染咸水鱼；除冷水鱼外，在30高温生长的日本鳗及泥鳅也发现有感染。三、禽双RNA病毒属（Avibirnavirus）传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus）同义名：传染性法氏囊炎病毒，盖姆波罗病(盖姆波罗（Gumboro）是1957年最早发现传染性法氏囊病的一个美国地名)病毒，鸡肾病变病毒。传染性法氏囊病（IBD）是鸡的急性、高度接触传染性、杀淋巴细胞性疾病，主要发生于38周龄的幼鸡，但也曾见于3月龄以上的鸡。病鸡精神沉郁，羽毛逆立，下痢，震颤，共济失调。发病率可达100%，死亡率为515%，有时高达20%以上，并发或继发感染所致的死亡率更高。剖检见法氏囊严重水肿，并有坏死灶，内含淡黄色胶冻样渗出物，粘膜面上有时有出血点或出血斑。病后期的法氏囊可能萎缩。鸡尸可能并不消瘦，但胸肌、腿肌上常有出血斑的存在。肾小管和输尿管内有尿酸盐沉积，心包和肝脏表面也常出现尿酸盐。2周龄以下的雏鸡发生感染时，大多呈亚临床感染。 由于本病侵害体液免疫中枢器官法氏囊，导致免疫抑制，从而降低机体对其它传染病的免疫反应性。鸡早期感染传染性法氏囊病毒后，对其它病毒和细菌的易感性增高，也能影响免疫接种效果，据报道，能降低新城疫疫苗免疫效果40%以上，降低马立克氏病疫苗免疫效果20%以上。 本病遍布于全球养禽地区，在工业化养鸡业发达的国家尤为严重，只有新西兰例外，目前无IBDV感染的鸡群。我国于1979年先后在北京、广州、上海等地发现本病，现已传遍全国各地，给养鸡业造成了很大的经济损失。图20-1 传染性法氏囊病病毒结晶状排列，N为细胞核 自周蛟等 1. 形态本病毒无囊膜、呈廿面体立体对称。三角剖分数T=13。有单层衣壳，病毒粒子直径约60nm，除完整病毒粒子外， 还常见有空衣壳。2. 理化学特性 目前公认IBDV有4种结构多肽: Vp1、Vp2、Vp3、Vp4，分子量分别为90kDa、41kDa、32kDa和28kDa。其中Vp2和Vp3是病毒的主要结构蛋白，在血清型病毒中分别占51%和40%（Dobos等，1979），而Vp1和Vp4分别占3%和6%，是病毒的次要蛋白质。除了上述蛋白质之外，也观察到附加体蛋白质Vpx，被认为是Vp2的前体。IBDV是双RNA病毒科中最先测定核苷酸序列的病毒，基因组的两个节段中A片段3 3003 400bp，主要包括一个大的ORF，编码分子量110kDa的多聚蛋白Vp2Vp4Vp3；B片段长2 8002 900bp，编码Vp1。完整病毒粒子在氯化铯中浮密度为131134g/cm3。病毒非常稳定，对乙醚和氯仿不敏感，高度抗酸（pH2）。56 5小时或60 30分钟仍有活力。pH12或70 30分钟条件下病毒死亡，05%氯化铵作用10分钟能杀死病毒。3. 抗原性 已知IBDV有2个血清型，可用病毒中和试验区别。型病毒对鸡有致病力，对火鸡无致病力；型病毒对鸡和火鸡不致病或只有很弱的致病力。两个血清型病毒抗原的相关性小于10%，因此交叉保护力很低，体内有血清型病毒的抗体仍然可以受到血清型病毒的感染。Lee和Lukert曾提出可能存在第个血清型，但目前尚无足够的资料。应用琼扩、荧光抗体和ELISA试验发现，IBDV带有共同的群抗原。两种多肽Vp2和Vp3都含有决定群抗原的抗原决定簇，只有Vp2具有型特异的抗原。经常发生变异的部位主要在Vp2的可变区，该区域的变化构成了抗原漂移的主要原因。已知型至少有6个亚型，作中和试验时亚型之间仅有一定程度的交叉，可以通过交叉中和试验和交叉攻毒试验进行鉴定。近年来在接种标准株疫苗而免疫失败的鸡群中分离出IBDV超强毒（vvIBDV）或变异株（variant），鉴定出的强毒分离物可引起与炎症或水肿无关的法氏囊损害。这些抗原性和病原性变异株的蔓延扩散，使得IBD的防制复杂化。5. 病原性本病毒的自然宿主为鸡和火鸡，其它禽类未见感染，鸡是唯一自然感染发病的动物。所有品系的鸡均可发病。36周龄的仔鸡最易感。年龄较大的鸡具有一定抵抗力，小于3周龄的雏鸡感染后会产生严重的免疫抑制。潜伏期短，人工感染后23天出现临床症状。在易感鸡群中，初发的法氏囊病多呈急性型。通常于感染后第3天开始死亡，并于57天达最高峰，以后逐渐减少。本病突出的表现为发病突然，发病率高，死亡集中发生于很短的几天时间内以及鸡群的康复较为迅速。病死鸡呈现脱水现象，股部和胸部肌肉经常有出血，呈条状或块状。肠粘膜与腺胃有出血，肾脏苍白肿大。法氏囊是本病毒的主要靶器官，变化最为明显。感染初期法氏囊水肿、出血，表面有胶胨状黄色渗出液，表面的纵纹变得明显，颜色由白变成乳白色，至第4天肿胀最大，约较正常法氏囊大23倍，第5天开始恢复正常大小，以后逐渐萎缩，到第8日仅为正常大小的1/3。病理组织学变化主要局限于法氏囊、脾脏、胸腺、哈德氏腺和盲肠扁桃体的淋巴结内，以髓状淋巴组织细胞坏死为特征。法氏囊受损最严重，感染后第1天就观察到法氏囊滤泡髓质区的淋巴细胞坏死、变性。IBD是高度接触传染性的，病毒持续存在于鸡舍的环境中，可通过直接接触从鸡传于鸡，或通过污染病毒的各种媒介物如饲料、饮水、尘土、器具、垫料、人员衣鞋、昆虫机械等间接传播，也可能通过种蛋垂直传播。将病毒滴入易感鸡的眼内，也易引起感染。常规措施通常不能使病鸡舍彻底消毒。病毒主要经消化道传入，开始在肠道巨噬细胞和淋巴细胞内初步增殖，然后随血流移至肝脏和法氏囊，经口人工感染后22小时就能在法氏囊淋巴细胞中检测到病毒。定居在法氏囊组织后，病毒大量增殖并释放到其它组织，产生第二次病毒血症。在法氏囊病的早期，病毒存在于除脑以外的绝大多数组织和器官中，其中以法氏囊和脾脏的含毒量最高，其次为肾脏。实验感染36周龄火鸡，仅表现轻微的临床症状，但是法氏囊有病理组织学变化，并能分离出。感染鹌鹑未能获得成功。 RNA电泳取病变法氏囊或感染鸡胚的组织乳剂以及感染细胞培养物，用SDS处理，苯酚氯仿抽提后，进行电泳，常可显出条清淅的带。具体方法参阅本书第十九章轮状病毒节。主要参考文献徐为燕等，1992。兽医病毒学(第十二章)。北京：农业出版社B. 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