转录因子PPT课件.ppt

转录调节因子 还有的蛋白质因子可特异识别 结合自身基因的调节序列 调节自身基因的表达 称顺式作用 由某一基因表达产生的蛋白质因子 通过与另一基因的特异的顺式作用元件相互作用 调节其表达 这种调节作用称为反式作用 反式调节 顺式调节 图13 3反式与顺式作用蛋白 指真核生物基因组中含有可以调控自身基因表达活性的特异DNA序列 顺式作用元件能够被特异转录因子识别和结合 从而影响基因表达活性 顺式作用元件的作用是参与基因表达的调控 本身不编码任何蛋白质 仅仅提供一个作用位点 要与反式作用因子相互作用而起作用 1顺式作用元件 cis actingelement 真核生物 顺式作用元件 按功能特征 真核基因顺式作用元件分为 启动子 promoter 增强子 enhancer 沉默子 silencer 1 1启动子 真核基因启动子是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件 至少包括一个转录起始点以及一个以上的功能组件 位于转录起点附近 是促进DNA转录的DNA序列 又称分子内作用元件 是DNA分子上可与RNA聚合酶结合并使之转录的部位 但启动子本身不被转录 生物中有许多启动子 如E coli约有2000个启动子 各启动子的效率可不相同 E coli的强启动子每2秒钟启动一次转录 而弱启动子每10分钟才启动一次 从百多个大肠杆菌启动子结构的分析 得知两个强启动子的同源序列的中心在转录起始部位 基因编码链上第一个核苷酸 5 侧约10和35个核苷酸处 弱启动子序列中往往有多处核苷酸被置换 根据启动子的转录模式可将其分为3类 组成型启动子 组织或器官特异性启动子和诱导型启动子 由两部分组成 核心启动子 CPE 指保证RNApol 转录正常起始所必需的 最少的DNA序列 包括转录起始位点及转录起始位点上游 25 30bp的TATA盒 它单独起作用时 只能确定转录起始位点并产生基础水平的转录 上游启动子元件 UPE 包括通常位于 70bp附近的CAAT盒 GC盒等 能通过TF D复合物调节转录起始的频率 提高转录效率 并非任何细胞型特异的蛋白在任何情况下都起作用 而是取决于核心启动子提供一个合适的环境来决定基因是被激活还是被抑制 构建多个启动子连接多个基因的表达载体 虽然可以实现同时转入多个基因的愿望 但这种载体一方面构建困难 另一方面如果引入的启动子之间仅仅有90bp的同源性顺序 导入生物体内 就会引起所谓的基因表达 共抑制 现象 而使基因沉默 因此 将极性启动子人工改造为高效双向表达的启动子 对于促进基因工程的进展具有重要意义 有研究表明 将单向极性植物表达启动子改造为能够双向表达的启动子对于植物基因工程研究和应用具有不可估量的作用 其应用前景十分广阔 Promoterelementsaredefinedbymutationsandfootprinting 用突变法和印迹试验法确定启动子元件 在合适的体外或体内检验系统中 启动子是根据其附着序列产生转录的能力来进行定义的 通过从一侧逐段缺失来确定启动子的边界 当一段缺失不会阻碍RNA合成 而下一段缺失使转录不再发生时 那么我们可以确定启动子的边界必然存在于两者之间 启动子克隆的几种方法 启动子的克隆对于构建基因工程载体 表达目的蛋白有着重要的意义 启动子克隆的方法很多 从常用的利用启动子探针型载体筛选启动子到PCR方法的应用 此后相继问世的一些基于PCR法的克隆启动子技术 像I PCR P PCR SSP PCR YADE TAIL PCR等 为克隆启动子提供了更可靠 更合理的方法 利用启动子探针载体筛选启动子利用启动子探针载体筛选启动子的过程为 先选用1种适当的限制性核酸内切酶消化切割染色体DNA 然后将切割产生的DNA限制片段群体与无启动子的探针质粒载体重组 并按照设计的要求使克隆的片段恰好插在紧邻报告基因的上游位置 随后再把重组混合物转化给寄主细胞 构建质粒载体基因文库 并检测报告基因的表达活性 利用PCR技术克隆启动子即根据发表的基因序列 设计引物 克隆基因的启动子 由于PCR法简便快捷 近年来人们较多采用此方法克隆基因启动子 苏宁等根据已报道的水稻叶绿体16SrRNA启动子基因序列设计5 启动子序列的引物 以水稻叶绿体DNA为模板 PCR扩增出16SrRNA基因5 启动子区的片段 酶切克隆到pSK的SacI和SphI位点 构建测序载体质粒pZ16S 进行序列测定 结果表明所克隆的片段长为144bp 含有SD序列 同源比较结果表明 所克隆的片段与水稻叶绿体16SrRNA启动子序列具有100 的同源性 环状PCR环状PCR包括I PCR Inverse PCR 和P PCR Panhandle PCR 这2种PCR都是根据一端已知序列设计的嵌套式引物进行PCR I PCR的实验程序包括 基因组DNA经酶切后用T4DNA连接酶进行自连接 产生环状DNA片段 以环化产物为底物 用根据已知片段设计的反向引物进行PCR扩增 从而得到含有未知片段的扩增产物P PCR是由Jones等提出的利用末端反向重复序列与已知序列互补配对形成环状单链模板 有效增强了引物与模板结合的特异性 反应需要3个根据已知序列设计的引物 3个引物在已知序列内呈线性排列 其中第3个引物可作为接头使用 可与已知序列互补配对形成锅柄状单链模板 其过程为 首先酶切基因组DNA 产生5 或3 粘末端 然后连接上合适的接头 primer3 连接好后最好用核酸外切酶I除去多余的接头 由于连接上的接头与已知序列是反向重复序列 变性后的DNA单链可退火形成锅柄状单链模板 之后分别用3个单引物进行3次PCR扩增 能有效地扩增2 9kbp的大片段未知序列 利用载体或接头的染色体步行技术克隆基因启动子这类方法的第一步都是酶切基因组DNA 连接载体或接头 既可以用pUCl8等质粒载体 也可以使用 DNA等噬菌体载体 只要选用的载体带有合适的酶切位点 同样根据实验需要 接头既可以是双链也可以是单链 然后根据基因组DNA序列设计的特异引物和载体的通用引物或接头序列进行扩增 TAlL PCR很早就有用随机引物的PCR 但由于无法有效地控制由随机引物引发的非特异产物的产生 所以一直未能广泛应用 近年来由IJiu等设计的TAIL PCR TermalAsymmetricInterlacedPCR 又叫热不对称交错PCR 则解决了这个问题 后来有研究表明 经改良过的TAIL PCR成功地从突变体中克隆到外源插入基因的旁侧序列 从而为启动子的克隆提供了有效的新方法 TAIL PCR的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物 specialprimer 简称sp1 sp2 sp3 约20bp 用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物 Arbitrarydegenerateprime AD 约14bp 相组合 以基因组DNA为模板 根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环 通过分级反应来扩增特异引物 与启动子功能变异有关的疾病 以下是从人类孟德尔遗传学 OMIM 证实与启动子故障有关 不论是因启动子序列直接突变或是转录因子或转录共激发因子的突变 哮喘 地中海贫血 鲁宾斯坦泰比综合症等 启动子的优化关于启动子的优化 可将所有的影响因素和其水平列一个表 选择合适的正交表去做 另外关键的几个区域如TATABox等是不能动的 然后看增强子等顺式元件及阻遏 诱导蛋白接合区域的情况 进行缺失突变和置换突变 等等 特点 1 它能通过启动子大幅度地增加同一条DNA链上靶基因转录的频率 一般能增加10 200倍 有的甚至可达千倍 2 增强子的作用对同源或异源的基因同样有效 如把SV40的增强子连接到兔 珠蛋白的基因上 可使转录强度增大100倍 3 增强子的位置可在基因5 上游 基因内或其3 下游的序列中 增强效益与其位置和取向无关 4 增强子所含核苷酸序列大多为重复序列 其内部含有的核心序列 对于它进入到另一宿主之后重新产生增强子效应至关重要 5 增强子一般都具有组织和细胞特异性 6 增强子在DNA双链中没有5 与3 固定的方向性 7 增强子可远离转录起始点 通常在1 4kb 个别情况可达30kb 外起作用 8 增强子的活性与其在DNA双螺旋结构中的空间方向性有关 另外 许多增强子还受到外部信号的调控 如金属硫蛋白基因的增强子就可对环境中的锌 镉浓度作出反应 从机能上讲 没有增强子存在 启动子通常不能表现活性 没有启动子时 增强子也无法发挥作用 有时 对结构密切联系而无法区分的启动子 增强子样结构统称启动子 通常描述的 具有独立的转录活性和决定基因时间 空间特异性表达能力的启动子就是这类定义的启动子 2反式作用因子 trans actingfactor 指能直接或间接识别和结合在顺式作用元件上 调控靶基因表达的蛋白质因子 也称为转录因子 transcriptionalfactor TF 所有细胞中的DNA都是一样的 但基因调控保证了每种细胞的特异性蛋白质会在正确的时间出现在正确的地点 控制这个过程的蛋白质就是转录因子 蛋白质 DNA 蛋白质 蛋白质相互作用 interaction 是其发挥功能的基础 基本转录因子 非特异转录因子 参与转录调控的因子转录调节因子转录激活因子 DNA 蛋白质 转录抑制因子共调节因子 蛋白质 蛋白质 特点 至少含3个功能结构域 DNA结合功能域 转录活性功能域 其他转录因子结合功能域 能识别并结合上游调控区中的顺式作用元件 对基因表达有正性或负性调控作用 即激活或阻遏基因表达 目前研究较广泛的有 识别TATA区的TF D 识别CAAT区的CTF 识别GGGCGG的SP1 识别热激蛋白启动区的HSF 2 1按功能特性分为 2 1 1基本转录因子 generaltranscriptionfactors 是RNA聚合酶结合启动子所必需的一组蛋白因子 决定三种RNA mRNA tRNA及rRNA 转录的类别 包括TF A TF B TF D TF E TF F TF H TF I等7种因子 真核RNA聚合酶 在转录因子帮助下 形成转录起始复合物 2 1 2转录调节因子 specialtranscriptionfactors 与增强子或各类应答元件等顺式元件结合 具有调节转录活性的一类功能蛋白 种类繁多 功能复杂 是细胞内信号转导系统的靶分子 为个别基因转录所必需 决定该基因的时间 空间特异性表达 如调控免疫球蛋白表达的核内蛋白质因子 NF 转录激活因子 起转录激活作用 通常是一些增强子结合蛋白质 转录抑制因子 起转录抑制作用 多数是沉默子结合蛋白质 转录调节因子结构 具有锌指结构的转录因子 如核受体家族 具有碱性DNA结合域的转录因子超家族 如碱性亮氨酸拉链 bZIP 转录因子 AP 1 ATF CREB等 具有螺旋 转角 螺旋 HTH 结构的转录因子 其他 如NF B家族 STAT家族 P53家族等 许多转录因子以同二聚体和异二聚体的形式发挥作用 所以它们据此可进一步细分成亚家族 正是由于许多转录因子能异二聚体化 从而极大地增加了转录调节的多样性和特异性 2 2按DNA结合域的结构分为 2 2 1锌指 zincfinger 锌指结构 DNA结合域中含较多的半胱氨酸和组氨酸的区域借肽链弯曲使2个组氨酸与2或4个半胱氨酸与1个锌络合成的指状结构 具有锌指结构的反式因子都含有几个相同的指结构 其指尖部插入DNA双螺旋深 浅沟中 调控相应基因 羧端无指 功能是与RNApol 或其他转录因子结合 常结合GC盒C CysH His C2H2型锌指 Zincfinger Zn Cys His 2 2 2亮氨酸拉链 leucinezipper bZIP 亮氨酸拉链 是DNA结合域中约30个氨基酸组成的核心序列 N段富含碱性氨基酸 形成DNA结合面 另一侧每隔6个氨基酸残基出现1个亮氨酸残基 称亮氨酸拉链区 两个具有亮氨酸拉链区的反式作用以疏水作用形成亮氨酸拉链 亮氨酸拉链的空间构象使反式因子碱性区域处于能与DNA结合的空间位置 是蛋白质二聚体化 蛋白质相互作用的一种方式 的一种结构基础 蛋白质通过亮氨酸拉链形成二聚体 大大增加对DNA的结合能力 调控基因表达 2 2 3螺旋 转角 螺旋 helix turn helix 有至少两个 螺旋区 中间有短侧链氨基酸残基形成转折 同源域蛋白通过其第三个螺旋与双链DNA的大沟相结合 其N端的多余臂部分则与DNA小沟结合 提高了稳定性 2 2 4螺旋 环 螺旋 helix loop helix HLH 结构 是含100 200个氨基酸残基的肽段 有2个 螺旋区 附近有1段富含碱性氨基酸区组成 螺旋区是形成二聚体必须的 碱性氨基酸区是结合DNA必需的 HLH类蛋白只有形成同源 异源二聚体时 才具有足够的DNA结合能力 2 3共调节因子 co regulators 或辅因子位于细胞核内 通常不直接与DNA结合 但能与转录因子作用 可在通用转录因子和转录调节因子间起架桥作用 并可改变局部染色质的构象 促进基因的转录 根据共调节因子对转录激活作用的影响 可分为共激活因子和共抑制因子两大类 共激活因子 co activators CoA 具有组蛋白乙酰化酶 histoneacetyltransferase HAT 的活性或能与HAT结合 HAT能使组蛋白乙酰化 导致缠绕核小体的DNA解旋 DNA模板裸露 使TF容易与DNA结合 从而促进转录 共抑制因子 co repressors 能与组蛋白脱乙酰化酶 histonedeacetylase HDCA 结合 通过后者使组蛋白去乙酰化 从而抑制基因转录 2 4转录调节因子的作用方式 通过二聚化 多聚化 磷酸化激活与顺式元件结合与基本转录因子相互作用与DNA结合后 转录因子须进一步与基本转录因子发生相互作用才能表现转录调节活性辅助因子的参与 线粒体转录因子A的研究进展 线粒体转录因子A mitochondrialtranscriptionfactorA TFAM 是参与线粒体DNA转录激活和调节线粒体DNA拷贝数的重要因子 TFAM由核基因编码 并被转入线粒体内发挥调节作用 除了转录激活作用外 TFAM还参与维持线粒体DNA mitochondrialDNA mtDNA 的拷贝数 改善线粒体功能以及调控肌浆网钙ATP酶表达等 转录调节因子的作用机制 3 常见转录调节因子及其功能 cAMP应答元件结合蛋白CREB激活蛋白 1 activatorprotein 1 AP 1 信号转导和转录激活因子STAT核因子 B NF B 3 1CREB家族 家族成员有CREB ATF1 CREM二聚化形成亮氨酸拉链与DNA结合 调节特定基因的表达是cAMP和钙调蛋白信号转导途径的最终靶分子 结合的顺式元件序列一般为5 TGACGTCA 3 称为cAMP应答元件 CRE 主要存在于基因的启动子与增强子上 cAMP激活PKA后 可解离出2分子催化亚单位 使CREB第133位的丝氨酸残基磷酸化 胞外Ca2 内流或从细胞内贮存库释放Ca2 时 也引起CREB第133位的丝氨酸残基磷酸化磷酸化的CREB与CRE回文序列结合 调控基因的表达 CREB 3 2AP 1 Fos Jun AP 1是即早基因家族c fos和c jun的蛋白产物Fos和Jun结合成的异源二聚体 或Jun的同源二聚体 前者活性高于后者AP 1顺式元件序列为TGACTCA 以亮氨酸拉链与DNA结合 引起细胞增生 分化等效应AP 1继cAMP和Ca2 后 起信号转导的中介作用 因此也被称为第三信使AP 1二聚体也是亲电子应答元件EPRE的识别因子 O2 H2O2的形成可同时激活NF B和AP 1 诱导胶原酶和金属硫蛋白的表达 3 3STAT家族Signaltransducersandactivatorsoftranscription STAT家族包括STAT1 6 氨基酸数目为734 851 主要差别在C末端 STAT分子含有几个高度保守的功能区STAT二聚体形成亮氨酸拉链与DNA结合STAT对机体免疫反应的调节起重要作用可被IFN 生长因子 血管紧张素 IL 6 IL 10等活化可被IFN IFN 活化诱导各种急性相的应答基因表达被IL 2活化 促进Th1细胞分化被IL 4活化 介导MHC 抗原 各类Ig类受体及其他细胞表面蛋白质的向上调节 IL是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子 由于最初是由白细胞产生又在白细胞间发挥作用 所以由此得名 STAT家族的活化 细胞因子及催乳素与其受体结合 激活受体偶联型酪氨酸蛋白激酶JAK家族成员 后者使STAT分子中的Tyr残基磷酸化 进而形成活化的二聚体 穿过核膜结合到特定DNA序列上调节基因表达 称为JAK STAT途径生长因子的跨膜受体具有酪氨酸蛋白激酶活性 与相应生长因子结合后 可直接使STAT磷酸化血管紧张素 受体与G蛋白偶联 可能通过G蛋白使STAT磷酸化 JAK STAT途径 JAK即JanusKinase 两面神激酶 是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶 PTK 该族成员有7个同源区 JH1 7 其中JH1区为激酶区 JH2区为伪激酶区 与其它PTK不同 JAK内无Src同源区2 SH2 结构 因其既能催化与之相连的细胞因子受体发生酪氨酸磷酸化 又能磷酸化多种含特定SH2区的信号分子从而使其激活 故称之为Janus 罗马神话中前后各有一张脸的门神 STAT即Signaltransducersandactivatorsoftranscription 信号传导及转录激活因子 含有SH2和SH3结构域 可与特定的含磷酸化酪氨酸的肽段结合 当STAT被磷酸化后 发生聚合成为活化的转录激活因子形式 进入胞核内与靶基因结合 促进其转录 该途径的基本作用模式 配体诱发相应受体形成二聚体或寡聚体 引起与受体结合的JAK相互作用 发生自身酪氨酸磷酸化而激活 同时催化受体发生酪氨酸磷酸化 继而以这些磷酸化的酪氨酸为 锚点 招引多种含特定SH2区的信号分子 并将其活化 通过这些分子的作用使胞外信号传入胞核内 MAPK与JAK STAT途径 MAPK即丝裂原激活的蛋白激酶 Mitogenactivatedproteinkinase 是Ras途径中的下游信号分子 具有丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶活性 可激活C Fos C Jun等转录调节因子 形成AP 1作用于核内 激活特定的基因从而传递信号 MAPK的激活需要其分子中特定的Tyr残基和Ser残基同时被磷酸化 以前认为 Ras途径与JAK途径虽共存于细胞因子的信号传导中 但互相独立 最近发现 MAPK可能处于调节这两条途径的关键位置 JAK的激活伴有MAPK的活化 但仅有JAK激活不足以使STAT最大程度地发挥其转录激活活性 Stat3在传导信号时不仅发生了Tyr残基磷酸化 同时还有Ser残基磷酸化 且磷酸化的Ser残基为与DNA上的调节区结合所必需 STAT蛋白上存在可被MAPK识别且磷酸化的特异性序列 与Stat3类似 Stat1也必需有Ser残基磷酸化才能完全活化 非受体型酪氨酸蛋白激酶 PTK SH PTP1的负反馈调节作用 SH PTP1即含SH2区的酪氨酸磷酸酶 PTPase1 PTPase分为跨膜型与非跨膜型两种 SH PTP1和2都属于后者 SH PTP2参与受体型PTK介导的信号传递 可看作是一种正的信号传递分子 SH PTP1则主要对PTK介导的信号传递起抑制作用 已知IL 3和EPO都主要通过JAK2传导信号 EPOR上第429位酪氨酸在EPO作用后被JAK磷酸化 从而具备了结合SH PTP1并使之活化的能力 这一作用的特异性取决于该残基周围特定的氨基酸序列 即PY Leu Tyr Leu Val Val 含有这段序列的11肽即足以结合并活化SH PTP1 EPOR上此种酪氨酸的缺失可使细胞对EPO的敏感性升高5到10倍 IFN 作用后 IFN 受体可与SH PTP1可逆性结合 同样 接受这种刺激的Moptheaten小鼠巨噬细胞中 JAK1和Stat1酪氨酸磷酸化水平明显高于正常 而对 型IFN信号传导同样重要的TYK2 Stat2活化水平则无明显变化 JAK和STAT的功能 STATs调节的基因范围很广IFN调控基因的表达需要Stat1和2 IL 6诱导的急性期反应基因的表达需要Stat3 Stat5介导催乳素诱导的多种基因表达 Stat6为IL 4诱导的免疫球蛋白类别转换和MHC 类抗原与免疫球蛋白受体等的上调所必需 JAK能直接或间接磷酸化Vav PLC 1等其它信号分子 从而激活其它信号传导通路 IL 4诱导的胰岛素受体底物 IRS 1 2的磷酸化也需JAK的活化 JAK和STAT除了共同构成JAK STAT途径传导信号外 各有其相对独立的作用 NF B为一个转录因子蛋白家族 包括5个亚单位 Rel cRel p65 RelA NF B3 RelB和p50 NF B1 p52 NF B2 p65 cRel和RelB含有N端Rel同源区 Relhomologydomain RHD 和C端的反式激活结构域 transactivationdomain TD 在RHD的C末端有一个核定位区域 nuclear localizationsequence NLS 负责与DNA结合 二聚体化和和核易位 而TD则与转录活化相关 p50和p52只有RHD而缺乏TD 因此 p50和p52同源二聚体并不能激活基因转录 而是作为一种抑制分子存在 它们在细胞内通常各自以其前体p105和p100的形式存在 两个亚基形成的同源和 或异源二聚体与靶基因上特定的序列 B位点 结合调节基因转录 不同的NF B二聚体在选择结合序列时可能略有差异 这是NF B通过不同的二聚体的形式对不同基因的表达进行精细调节的一种方式 3 4NF B家族 最常见的NF B二聚体是p65与p50组成的异二聚体 NF B的抑制单位I B通过其C末端特定的锚蛋白重复序列 ankyrinrepeatmotif 与NF B结合 并覆盖NLS阻止NF B向细胞核内转移 在静息的细胞中 NF B和I B形成复合体 以无活性形式存在于胞浆中 当细胞受细胞外信号刺激后 I B激酶复合体 I Bkinase IKK 活化将I B磷酸化 使NF B暴露核定位位点 游离的NF B迅速移位到细胞核 与特异性 B序列结合 诱导相关基因转录 I B解离机制的几种假说 蛋白磷酸化 要活化NF B I B必须发生蛋白酶解 故需要蛋白激酶和蛋白磷酸酶参与活性氧的作用 特别是过氧化物在NF B活化中起一定作用 其机制可能是通过信号转导 间接作用于胞质的NF B I B复合体遍在蛋白的作用 I B和p105磷酸化后被遍在蛋白缀合酶识别 使I B和p105遍在蛋白化 经蛋白酶小体降解加工 I B降解 释放出p105 p65蛋白复合体 经加工后生成有活性的NF B NF B已存在于细胞质 不需要新合成与I B简单的解离反应就可触发激活NF B主动参与胞质 胞核信号转导