第十四章 液相色谱-质谱联用.ppt

1 14 3液相色谱 质谱联用分析法14 3HyphenatedTechnologyofHPLC MS 液相色谱 质谱联用 LC MS联用 2 对于热稳定性差 不易汽化的样品 GS MS联用有一定的困难 因此 近年来又发展了液相色谱 质谱联用技术 LC分离要使用大量的液态流动相 如何有效地除去流动相而不损失样品 是LC MS联用的难题之一 目前应用较多的有两种接口装置 LC MS用传送带联接装置 3 一 高效液相色谱 质谱联用仪二 离子源三 质量分析器四 串联四级质谱法的扫描方式和模式五 检测器和真空泵六 LC MS分离条件的选择和优化七 注意事项见建议 4 一 液相色谱 质谱联用仪 1 液质联用仪组成流程 5 气相色谱 质谱联用 GC MS 高效液相色谱 质谱联用 HPLC MS 也可以质谱 质谱联用 MS MS 基于色谱和质谱的仪器灵敏度相当 加之使分离效果好的色谱成为质谱的进样器 而速度快 分离好 应用广的质谱仪作为色谱的鉴定器 使它们成为目前最好的用于分析微量的有机混合物的仪器 一 液相色谱 质谱联用仪 2 液质联用仪类型 6 气质联用仪 GC MS 是最早商品化的联用仪器 适宜分析小分子 易挥发 热稳定 能气化的化合物 用电子轰击方式 EI 得到的谱图 可与标准谱库对比 液质联用 LC MS 主要可解决如下几方面的问题 不挥发性化合物分析测定 极性化合物的分析测定 热不稳定化合物的分析测定 大分子量化合物 包括蛋白 多肽 多聚物等 的分析测定 没有商品化的谱库可对比查询 只能自己建库或自己解析谱图 液质联用与气质联用的区别 7 LC MS联用仪系统构成 8 广适性检测系统 3 液质联用的优势 一 液相色谱 质谱联用仪 9 分析热不稳定化合物分析气相色谱 质谱无法分析的样品分析大分子量的化合物 如生化样品极高的灵敏度 10 进一步增加HPLC的分离能力 11 4 LC MS联用中的转变过程 液相色谱的现实情况 从高效液相色谱流出的化合物存在于大气压条件下的溶液之中质谱的现实情况 在高真空工作条件下的质谱仅接受气相的离子 因此 液质联用的接口必须完成 带电状态 中性 离子物态转变 液态 气态真空变化 760torr 10 510 8torr 从LC MS转变 LC MS转变过程 去除溶剂保留样品电离化合物 12 接口 13 API接口 Z Spray接口 14 二 离子源 大气压电离 API 技术目前 LC MS采用大气压离子化 Atmosphericpressureionization API 技术作为液质联用的接口技术 也是质谱离子化技术 API主要包括 电喷雾electrosprayionization ESI大气压化学电离atmosphericpressurechemicalionization APCI 离子源 使样品产生离子的装置叫离子源 15 一 电喷雾离子源ESI 二 大气压化学电离APCI 三 ESI与APCI比较 二 离子源 16 电喷雾离子化ESI接口电喷雾离子化ESI特征电喷雾离子化ESI过程影响化合物ESI电离的因素 一 电喷雾离子化ESI 17 1 ESI接口 一 电喷雾离子源 氮气用来做去溶剂气和锥孔气氩气做碰撞气 先形成带点电荷 18 低分子量化合物一般产生单电荷离子 失去或得到一个质子 高分子量生物大分子和聚合物产生多电荷离子几乎没有碎片离子可能生成加合物和 或多聚体 常见的是溶剂加合物和NH4 M 18 Na M 23 和K M 39 加合物灵敏度取决于化合物本身和基质 一 电喷雾离子源 2 ESI特征 19 1 形成带电小液滴 2 溶剂蒸发和小液滴碎裂 3 最终形成气相离子 3 电喷雾离子化ESI过程 一 电喷雾离子源 20 1 形成带点离子 3 电喷雾离子化ESI过程 21 22 2 溶剂蒸发和小液滴碎裂 3 电喷雾离子化ESI过程 23 3 形成气相离子 对于半径10nm的液滴 电荷的排斥作用导致离子从液滴表面蒸发而不是液滴的分裂 离子从溶液中转移至气相 3 电喷雾离子化ESI过程 24 4 ESI MS的基本离子化原理是 溶剂由液相泵输送到ESI毛细管 经其内的不锈钢毛细管流出 在ESI高压电极处施以负的高电压 小液滴从毛细管高速喷出而带有过量的负电荷 从而产生电化学反应 通过溶剂组分氧化而去掉正离子或通过毛细管自身的氧化而增加负离子 在高温和氮气的吹扫下 溶剂逐渐挥发 变成小颗粒的液滴 由于高电场作用 极性溶质成为带电离子溶解在溶剂液滴上 当溶剂颗粒逐渐减小 小到一定程度 带电的溶质粒子便从液滴表面蒸发出来 形成带电离子 完成离子化 25 4 影响化合物ESI电离的因素 a 化合物的浓度 b 基质的性质 c 化合物的表面活性 d 流速 26 离子的释放取决于浓度 信号在10 M时达到饱和 线性动态范围限制在2 3个数量级信号的饱和归因于离子在液滴表面过于密集 致使某些样品离子不能到达液滴表面 ESI 样品浓度对其响应的影响 27 28 ESI 基质对样品响应的影响 一般而言 样品信号强度响应随着其它电解质浓度的增高而降低 这一现象叫作 离子抑制 样品离子和电解质离子对电荷及占据液滴表面的竞争导致离子抑制 表面竞争 电荷竞争 29 基质选择一般原则 一般而言 对于正离子检测模式 样品必须比基质更具碱性 以便形成 M H 或足够的极性去形成稳定的加和离子 例 M NH4 对于负离子检测模式 样品必须比基质更具酸性 以便形成 M H 或足够的极性去形成稳定的加和离子 例如 M OAc ESI 基质对样品响应的影响 30 ESI 流速对样品响应的影响 ESI响应随流速的增加而降低对ESI接口来说 最佳工作流速为100 250 L min 31 大气压化学电离源APCI接口大气压化学电离源APCI特征大气压化学电离源过程 二 大气压化学电离源APCI 32 二 大气压化学电离源APCI 1 APCI接口 雾化 33 2 大气压化学电离源APCI特征 一般而言 只生成单电荷离子几乎没有碎片离子可能生成加合物和 或多聚体 一般是溶剂加合物及NH4 M 18 Na M 23 和K M 39 加合物基质影响较小 相对于ESI 质谱图不受缓冲盐及其缓冲力变化的影响 34 3 大气化学电离过程 大气压化学电离可分为以下两个步骤 1 快速蒸发 2 气相化学电离 电晕放电 35 1 快速蒸发 液流被强迫通过一根窄的管路以使其得到高的线速度高温加热器和喷雾器使液流在脱离管路时蒸发成气体 由于溶剂蒸汽的保护 样品分子较少受热裂解的影响 大量的热量用于溶剂的蒸发 但是有时也会有热不稳定样品分解 36 2 气相化学电离 37 Needle喷雾针 CoronaNeedle电晕针 reagentgas试剂气 离子 分子反应 2 大气压化学电离源APCI 38 大气压化学电离源APCI 离子 分子反应 质子转移 电子捕获 电荷交换 离子加和 适合于热稳定 易气化的小分子低极性化合物 39 三 ESI与APCI的比较 共同点 都属于大气压电离法 API 通常产生 M H 或 M H 等准分子离子 都使用高电压元件和雾化气喷雾法产生气相离子 产生极少的碎片 但可以控制产生结构碎片 40 ESI与APCI的比较 不同点 生成离子方式不同 样品兼容性不同 流速兼容性不同 ESI 液相离子化 APCI 气相离子化 ESI 0 2 0 5ml min APCI 0 5 1ml min ESI 极性化合物和生物大分子 APCI 非极性 小分子化合物 相对于用ESI电离的化合物而言 且有一定的挥发性 41 42 样品已经变成气相离子样品仍处于大气压下必须把样品送入质谱高真空环境中 43 蒸气通过样品锥孔进入一级真空区 离子源区 并且膨胀蒸气在膨胀时会冷却这种冷却可能导致在被分析物离子上的溶剂冻结从而生成各种质量数的簇离子 一级真空 成簇过程 簇离子会降低所要检测的被分析物质量处的信号 簇离子会增加背景信号 44 加热一级真空区 离子源区 以阻止簇离子的生成 使不带溶剂的样品离子被检测在通过加热的离子源区以后 样品离子在静电场作用下通过萃取锥孔通过萃取锥孔后 样品离子进入六极杆聚焦透镜从六极杆聚焦透镜出来 样品离子进入四极杆质量分析器 45 三 质量分析器 双聚焦扇形磁场 电场串联仪器 sector 四极质谱仪 Q 飞行时间质谱仪 TOF 离子阱质谱仪 TRAP 四极 TOF Q TOF 串列式多级质谱仪 三重四极 QqQ MS MS TOF TOF 1 分类 46 单四极杆分析器Quadrupole 由四根棒状电极组成 直流电压 DC 射频电压 RF 形成二维四极电场 离子在场的作用下产生振动 碰到四极杆而被吸收 通过四极杆的离子到达检测器被检测 2 四级杆分析器 47 48 通过改变RF 从而改变通过的离子质量 离子质量 时间 49 串联质量分析器 空间串联 时间串联 空间 时间串联 四极杆串联Q Q Q 离子阱FTICR Q Trap 都有碰撞活化室 50 实验室现有的质量分析器类型 串联四极质谱仪 MS MS 三重四极 QqQ 离子源 第一分析器 碰撞室 第二分析器 接收器MS1MS2Q1q2Q3 第一级质量分析器 用于选择一个前体离子或母离子 然后 用适当的活化方法是这一离子裂解成产物离子或称子离子及中性碎片 mp mf mnmp 为前体离子 mf 为产物离子 mn为中性碎片 第二级质量分析器 用于产物离子分析如从产物中再选择一个离子 分析最后选择的离子的碎片 则标记MS MS MS 数级可进一步增加至n次 实现MSn实验 51 串联质量分析器 三重四极杆 三个四极杆串联Q Q Q Q1 质量分离 Q2 碰撞活化CIDCollision InducedDissociation Q3 质量分离 52 3 碰撞诱导解离CID质谱 QqQ检测器中的碰撞反应在CID中进行 选择一定质量的离子作为母体离子 进入碰撞室 室内充有靶子反应气体 本实验室选择高纯氦 发生离子 分子碰撞反应 从而产生 子离子 再经MS2的分析器及接受器得到子离子质谱 一般称做CID collision induceddissociation 谱 53 CID产生的过程 54 4 影响CID质谱的因素 较大影响的因素有 所用碰撞气体的种类 压力 离子的能量 仪器的配置以及离子电荷状态由于在不同的仪器上不可能在完全相同的条件下去分析样品 任何一个给定的化合物将在不同的条件下给出差别或大或小的质谱 尤其是各个离子峰的相对丰度的差别几乎是无法避免的 因而目前尚难以建立商品化的谱库供检索使用 只能进行人工解析或自己建库 大气压电离技术中产生的离子为偶数电子离子 其主要的碎片应由化学键的诱导断裂和重排反应来产生 所以在EI质谱解析中总结出的偶数电子离子的开裂规则一般可适用于CID质谱的解释 55 四 扫描方式和扫描模式 全扫描 FullScan 子离子扫描 DaughterScan 母离子扫描 ParentScan 中性碎片丢失扫描 ConstantNeutralLossScan 选择离子监测 SIR 多反应监测 MRM 一 扫描方式 二 扫描模式 正离子模式负离子模式 56 1 全扫描 特征 质谱扫描得到一段质量范围从而获得质谱图 用于未知物的结构分析 用于SIR方法的开发以及MRM方法开发寻找母离子最佳电离参数 定性寻找总分子离子峰出峰时间 57 LC MS中常见的本底离子 m z50 150 溶剂离子 H2O nH n 3 112 m z102 H 乙腈 乙酸 C4H7NO2H 102 0549m z149 管路中邻苯二甲酸酯的酸酐 C8H4O3H 149 0233m z288 2mm离心管的产生的特征离子m z279 管路中邻苯二甲酸二丁酯C16H22O4H 279 1591m z316 2mm离心管的产生的特征离子m z384 瓶的光稳定剂产生的离子m z391 管路中邻苯二甲酸二辛酯 C24H38O4H 391 2843m z413 邻苯二甲酸二辛酯 钠 C24H38O4Na 413 2668m z538 乙酸 氧 铁 喷雾管 Fe3O O2CCH3 6 537 8793 58 scanned selectedm z CID 过程 通过Q1选择目标物质的母离子 在Q2发生碰撞反应 Q3对目标物质丰度最大的子离子进行扫描 2 子离子扫描 特征 监测单个离子或一系列单个离子 目标化合物的跟踪 提高采集灵敏度 100 230 59 子离子质谱图 用MS2质量分析器扫描指定母离子的子离子碎片 所得到的质谱图只能是由指定母离经碰撞产生 60 子离子扫描质谱图 61 用MS1质量分析器扫描能丢失指定质谱碎片的母离子 所得到的母离子质谱峰一定是能丢失指定质谱碎片的母离子 母离子质谱图 3 母离子扫描 62 母离子扫描质谱图 63 4 中性碎片丢失 母离子扫描 中性丢失扫描可用来研究结构相似性化合物 如具有相同结构碎片 或相同结构基团的化合物 64 中性碎片丢失扫描质谱图 MS1质量分析器扫描能丢失指定中性碎片的母离子 MS2质量分析器扫描丢失指定中性碎片的离子 所得到的质谱图是由MS1扫描的母离子 母离子只能是丢失指定中性碎片的离子 65 中性碎片丢失扫描质谱图 66 5 选择离子扫描 定量满足一般要求信噪比不如MRM只监测指定的离子 67 选择离子记录 SIR MS1质量分析器是静态 并且只监测指定的离子 68 选择离子记录扫描 69 6 多反应监测SRM MRM 特征 监测特定母离子产生特定子离子碎片的化合物 目标化合物的跟踪 提高采集灵敏度 是灵敏度最高的定量采集方式 定量最佳选择干扰小信噪比高 70 子离子质谱图 指定的母离子产生一指定的子离子 两个质量分析器都是静态的 71 多反应监测扫描 72 串联质量分析器 三重四极杆 73 化合物鉴别 全扫描方式 Q1扫描 全扫描数据采集可以得到化合物的准分子离子 从而可判断出化合物的分子量 用于鉴别是否有未知物 并确认一些判断不清的化合物 如合成化合物的质量及结构 子离子分析 MS MS 子离子 用于结构判断 得到化合物的二级谱图即碎片离子 和选择离子对作多种反应监测 MRM 子离子谱图与锥体电压断裂谱图 源内CID 可能十分相似 所不同的是子离子质谱图已知只有一种质量通过MS1 因此也已知所有碎片离子都是由我们所选定的母离子所产生的 所以我们更相信由MS MS产生的谱图的纯度 74 二 扫描模式 一般的商品仪器中 ESI和APCI接口都有正负离子测定模式可供选择 一般不要选择两种模式同时进行 正 负离子模式建议根据文献选择 75 正离子模式 适合于碱性样品 可用乙酸或甲酸对样品加以酸化 样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式 2 负离子模式 适合于酸性样品 可用氨水或三乙胺对样品进行碱化 样品中有较多的强伏电性基团 如含氯 含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式 二 扫描模式 选择的一般原则为 76 电子倍增管 光电倍增管 电子倍增管 打拿极 PC 五 检测器和真空泵 77 高真空泵 10 6Torr 油扩散泵 涡轮分子泵 极限真空可达10 5 10 6Torr 蒸汽喷射泵 泵液蒸汽返流 提高本底 易污染系统 五 检测器和真空泵 78 高真空泵 10 6Torr 油扩散泵 涡轮分子泵 真空可达10 5 10 6Torr 小型蒸汽涡轮机 高速旋转叶片 贵 易损 79 真空系统其他附件 真空规 真空计 真空管道 真空阀门 吸附阱 抽气方式 单泵抽气方式 双泵差动抽气方式 80 1 样品的预处理 从保护仪器角度出发 防止固体小颗粒堵塞进样管道和喷嘴 防止污染仪器 降低分析背景 排除对分析结果的干扰 要求获得最佳的分析结果 从ESI电离的过程分析 ESI电荷是在液滴的表面 样品与杂质在液滴表面存在竞争 不挥发物 如磷酸盐等 防碍带电液滴表面挥发 大量杂质防碍带电样品离子进入气相状态 增加电荷中和的可能 六 LC MS分离条件的选择和优化 分离条件选择 81 样品的预处理常用方法 a 超滤b 溶剂萃取 去盐c 固相萃取d 灌注 Perfusion 净化 去盐e 色谱分离反相色谱分离亲和技术分离f 甲醇或乙腈沉淀蛋白g 酸水解 酶解h 衍生化 82 2 电离源的选择ESI适合于中等极性到强极性的化合物分子 特别是那些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子 蛋白质 只要有相对强的极性 ESI对小分子的分析常常可以得到满意的结果 APCI不适合多电荷的大分子分析 它的优势在于非极性或中等极性的小分子的分析 83 电离方式ESI采用离子蒸发方式使样品分子电离 而APCI电离是放电探针促使溶剂和其它反应物电离 碰撞及电荷转移等方式形成了反应气等离子区 样品分子通过等离子区时 发生了质子转移 样品流速APCI源允许的流量相对较大 0 2 2mL min 而ESI源允许流量相对较小 最大只能为1 0mL min 断裂程度APCI源的探头处于高温 可使热不稳定的化合物分解 产生碎片 ESI源探头处于常温 常生成分子离子峰 不易产生碎片 灵敏度都很高 ESI有利于分析生物大分子及其他分子量大的化合物 而APCI更适合于分析极性小的化合物 多电荷APCI源不能生成一系列多电荷离子 所以不适合分析生物大分子 而ESI源特别适合于蛋白质 多肽类的生物分子 由于它能产生一系列的多电荷离子 84 3 正负离子模式的选择 正离子模式适合于碱性样品 可用乙酸 pH 3 4 或甲酸 pH 2 3 对样品加以酸化 负离子模式适合于酸性样品 可用氨水或三乙胺对样品进行碱化 有些酸碱性并不明确的化合物 可优先选用APCI 进行测定 85 4 流动相的选择 常用的流动相为甲醇 乙腈 水和它们不同比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液 如甲酸铵 乙酸铵等 还可以加入易挥发酸碱如甲酸 乙酸和氨水等调节pH值 LC MS接口避免进入不挥发的缓冲液 避免含磷和氯的缓冲液 含钠和钾的成分必须 lmmol l 盐分太高会抑制离子源的信号和堵塞喷雾针及污染仪器 含甲酸 或乙酸 2 含三氟乙酸 0 5 含三乙胺 l 含醋酸铵 10一5mmol l 送样前一定要摸好LC条件 能够基本分离 缓冲体系符合MS要求 86 不适合的溶剂和缓冲液a不挥发的盐b表面活性剂 洗涤剂c无机酸其它溶剂和调节剂a异丙醇 2 甲氧基乙醇及乙醇等b三氟醋酸 TFA 常用于LC MS分析肽和蛋白质的化合物c三乙胺 TEA d四氢呋喃 THF 87 5 流量和色谱柱的选择 不加热ESI的最佳流速是1 50ul min 应用4 6mm内径LC柱时要求柱后分流 目前大多采用l 2 1mm内径的微柱APCI的最佳流速 lml min 常规的直径4 6mm柱最合适 为了提高分析效率 常采用 100mm的短柱 此时UV图上并不能获得完全分离 由于质谱定量分析时使用MRM的功能 所以不要求各组分没有完全分离 这对于大批量定量分析可以节省大量的时间 88 6 辅助气体流量和温度的选择 雾化气对流出液形成喷雾有影响 干燥气影响喷雾去溶剂效果 碰撞气影响二级质谱的产生 操作中温度的选择和优化主要是指接口的干燥气体而言 一般情况下选择干燥气温度高于分析物的沸点20 左右即可 对热不稳定性化合物 要选用更低的温度以避免显著的分解 选用干燥气温度和流量大小时还要考虑流动相的组成 有机溶剂比例高时可采用适当低的温度和流量小一点的 89 用大气压电离质谱仪可以得到分子量信息 正离子方式常出现如下离子 Na22Da higherthanM H K38Da higherthanM H Li6Da higherthanM H NH417Da higherthanM H ACN40Da higherthanM H2M H 2M Na等负离子方式常出现如下离子 TFA114Da higherthenM H 113and227background Acetate60Da higherthenM H Formic46Da higherthenM H Cl36Da higherthanM H 90 影响分子量测定的因素 1 pH的影响 正离子方式pH要低些 负离子方式pH要高些 除对离子化有影响外 还影响LC的峰形 2 气流和温度 当水含量高及流量大时要相应增加 3 溶剂和缓冲液流量 流速适当高可以提高出峰的灵敏度 4 溶剂和缓冲液的类型 通常正离子用甲醇好 负离子乙腈好些5 选择合适的液相色谱类型 正相 反相 选择合适的色谱柱6 合适的电压 DP电压高时 样品在源内分解或碎裂 高DP电压时回使多电荷离子比例低 多聚体也减少7 样品结构和性质8 杂质的影响 溶剂的纯度 水的纯净程度等 当成分复杂 杂质太多时 竞争使被测物离子化不好 同时使LC分离不好9 样品浓度不够 有时需要浓缩 91 分子量测定失败的原因 a 流动相不合适b 不挥发性盐的影响c 成分复杂 杂质太多d 样品浓度不